流式细胞术应用 | 13 色淋巴亚群免疫功能检测
贝克曼库尔特
实验简介
13 色淋巴亚群免疫功能检测，利用高度集成，卓越检测性能的 CytoFLEX 对外周血中高度异质的 T 淋巴细胞亚群进行分析，10 色 Duraclone IM T 细胞试剂盒 (CD45RA-FITC，CD197-PE，CD28-ECD，CD279-PC5.5，CD27-PC7，CD4-APC，CD8-Alexa-Fluor 700，CD3-APC-AF750，CD57-Pacific Blue，CD45-Krome Orange) 为贝克曼最新用于淋巴亚群检测的干粉试剂。
加上 3 个液体试剂 (CD95-BV 605TM，CD25-BV650TM 以及 CD127- BV768TM ) 可进行 T 细胞 （CD3+）及其亚群细胞 T4（CD3+CD4+），T8 细胞（CD3+CD8+），中央记忆 T 细胞（CD45RO-CCR7+），效应记忆 T 细胞（CD45RO-CCR7-），天然 T 细胞（CD45RO+CCR7+）。
调节 T 细 胞（CD4+CD25+CD127low），干样 T 细胞（CD45RA+CCR7+CD95+CD127+）百分比及数量检测，有助于了解机体所处于的免疫功能状态，对疾病的辅助诊断、疗效评估、预后判断等十分重要，对机体亚健康状态的诊断及发生相关疾病的风险评估具有重要意义，也是近年来研究的热点之一。
材料与方法
▶ 试剂
▶ 样品制备
Sample Typ | 外周血 |
| Species | 人 |
| Age of specimen | 新鲜 EDTA 抗凝 |
| Prep Method | 1. 取新鲜抗凝人外周血 100 ul 放入 Duraclone T panel 流式管底，再各加入 5 ul 述 适量的抗体（CD95-BV605TM, CD25-BV650TM 以及 CD127-BV768TM），涡旋 30 sec，充分混匀； 2. 室温避光孵育 15 min； 3. 加入 1 mL 溶血素 Versa lysis，和 50ul 固定剂 IOTest 3 Fixative Solution（试剂均来 自 Beckman）涡旋 30 sec，充分混匀，并避光孵育 20 min； 4. 待红细胞溶解充分后，200 g 离心 5 min 去除上清， 并加入 3 mL 1 x PBS 洗涤一 次，离心，重悬于 500 ul 1 x PBS， 上机检测。 |
▶ 数据分析
1. 创建一个新的实验；
2. 按下图选择相应的通道及建立实验方案；
3. 采集的数据以 Lymph 门内至少获取 20000 个 events。
淋巴细胞（Lymph）通过 CD45/SS 设门，进一步利用 CD3/SS 散点图圈选淋巴细胞门内（Lymph）的 CD3+ 细胞， 对 CD3+ 细胞进行 CD4/CD8 作图，并分别对 CD4+，CD8+ 细胞 CCR7/CD45RA 表达情况进行分析， 四象限 分别代表纯真 T 细胞（CCR7+CD45RA+），效应 T 细胞（CCR7-CD45RA+），中央记忆 T 细胞（CCR7+CD45RA-）， 效应记忆 T 细胞（CCR7-CD45RA-）。
对 CD4+ 细胞 CD4/CD25 作图可分析调 T 表达，对 CD4+CD25+ 的细 胞进一步设门至 CD127/CD45RA，分析天然调 T 细胞（CD127+CD45RA+）以及记忆调 T 细胞（CD127+CD45RA-）， 效应调 T 细胞（CD127 hi+CD45RA-）。T8 细胞的成熟过程及活化可以用 CD27/CD28，CD57/CD279 散点图分析。
纯真 T 细胞（CD3+CCR7+CD45RA+）关联至 CD27/CD28，双阳性细胞群进一步关联至 CD96/CD127 散点图， 其中 CD96 hi+CD127+ 的细胞群为干样 T 细胞，具有分生潜能的 T 淋巴细胞。
实验结果
该 13 色的 T 淋巴亚群 panel 不仅可检测最常见的 T 淋巴亚群抗原，而且更注重对 T 淋巴细胞亚群及功能的研究， 初始 T 细胞及效应 T 细胞，以及表达稀有的 Treg 细胞干样淋巴细胞都是临床科研的重要的研究对象，从以上数据可以非常清楚区分各群细胞。
而常规的流式检测需要进行 2-3 管的检测，操作及检测过程复杂，费时费力， CytoFLEX 的卓越的检测灵敏度，以及多达 13 个荧光检测通道，友好的操作系统可以非常轻松地完成非常复杂 的多色检测。
