亚“G1”峰检测法检测细胞凋亡

处于增殖周期中的细胞，根据其所处不同周期时相（Go/G1、S、G2/M），其DNA含量分布在2n～4n之间。发生凋亡的细胞由于核内DNA裂解成许多小片段，在酒精固定后，用细胞膜通透剂使小分子量的DNA片段穿过胞膜。

使细胞原有的DNA部分丢失，仅剩下大片段DNA，这些细胞在DNA染色后，用流式细胞分析术检测其DNA含量，会出现一个DNA含量＜2n（即＜G1期细胞的分布区，称为“亚G1峰”。因此处于“亚G1峰”的细胞代表样品中的凋亡细胞。

【样品来源】

（1）悬浮生长的培养细胞；

（2）贴壁生长的培养细胞经胰蛋白酶消化后的细胞悬液；

（3）离体细胞悬液。

将样品分组，即空白对照组（未经诱导凋亡处理组）和实验组（经诱导凋亡处理组）。

【材料与试剂】

（1）PBS缓冲液；

（2）70％酒精；

（3）DNA抽提缓冲液：取 192ml 0.2mol/L Na2 HPO4 ，与8ml 0.1mol/L枸橼酸混合，调整pH到7.8；

（4）DNA染液：取200μg PI溶于10ml PBS，加入2mg无DNA酶活性的RNA酶。

【操作步骤】

（1）1～5×106 个细胞，用70％酒精固定（-20冰箱），2h以上；

（2）洗涤：离心，弃去酒精，细胞重新悬浮于10ml PBS中，再离心，弃去上清；

（3）DNA片段抽提：将细胞重新悬浮于0.5ml PBS，加入1ml DNA抽提缓冲液，混匀，室温下静置5min，离心，弃去上清；

（4）DNA染色：将细胞重新悬浮于1ml DNA染液，室温下避光染色30min；

（5）流式细胞仪测定：选用波长488nm 蓝色激发光，同时测定红色荧光和前向角散射光；每例样品测定5000～10000个细胞。

注：所有离心步骤均为1000r/min，5min。

【结果分析】

实验组（经诱导凋亡处理组）的 DNA 组方图上，在G1峰前出现一个呈高斯分布的峰（亚“G1”峰），分析峰的百分比即可得出凋亡细胞的百分比；空白对照组因无凋亡发生而不出现亚“G1”峰，或有些细胞系可有自发性细胞凋亡发生，但其百分比不超过5％；

发生坏死的细胞或机械性损伤之细胞在G1峰前不出现呈高斯分布的亚“G1”峰，但可出现一个连续的DNA小片段分布曲线，以此可与凋亡区分开来。