点杂交的检测

现在大多数的实验室里，常用的标记物为地高辛和生物素，下面主要介绍这两种标记系统的显色方法。

1．地高辛标记探针和PCR引物

[试剂与配置]

缓冲液Ⅰ：150mmol/L NaCl, 100mmol/L Tris-HCl (pH7.5)

缓冲液Ⅱ：0.5%阻断剂溶于缓冲液Ⅰ

缓冲液Ⅲ：100mmol/L NaCl, 100mmol/L Tris-HCl (pH7.5)，50mmol/L MgCl

TE缓冲液

抗地高辛抗体-碱性磷酸酶复合物(150U/ml)：用缓冲液Ⅰ1：5000新鲜稀释

显色液：NBT(35μl)＋BCIP(45μl)用TE配至100ml

[操作方法]

(1)缓冲液Ⅰ洗膜1min，加100ml缓冲液Ⅱ，室温放置30min；

(2)缓冲液Ⅰ洗膜1min，加入抗地高辛抗体-碱性磷酸酶复合物，室温放置30min；

(3)用缓冲液Ⅰ洗膜两次，每次15min；

(4)用100ml缓冲液Ⅲ平衡膜5min；

(5)加入10ml显色液，避光显色数分钟或数小时；

(6)条带清楚后，用50ml TE洗膜5min，可立即拍照，也可晾干后或在TE中湿润密封保存。

2．生物素标记探针

[试剂与配置]

缓冲液Ⅰ：100mmol/L NaCl, 0.5% Triton X-100溶于PBS

缓冲液Ⅱ：1mol/L 尿素，1%硫酸葡聚糖溶于缓冲液Ⅰ

缓冲液Ⅲ：100mmol/L 柠檬酸钠(pH5.0)

辣根过氧化物酶标记的亲合素或链霉亲和素：工作浓度

底物液：TMB 2mg/ml，溶于无水乙醇中

显色液：1份底物液加19份缓冲液Ⅲ

[操作方法]

(1)在漂洗后的杂交膜上加入工作浓度的酶标记的亲合素或链霉亲和素，室温孵育10min；

(2)缓冲液Ⅱ室温漂洗10min；

(3)缓冲液Ⅲ室温平衡膜5min；

(4)加底物液，避光室温孵育10min；

(5)加入新鲜配置的显色液：3%H2 O2 (2000：1，v/v)，显色1～15min

(6)出现蓝色信号后，加缓冲液Ⅲ终止反应，可立即拍照，也可在缓冲液Ⅲ中避光保存。