PCR产物的检测点杂交
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1.寡核苷酸探针杂交
[试剂与配置]
预杂交液:5×SSC,5×Denhadrt, 0.5%Triton X-100
2×SSC/0.1%SDS
1×SSC/0.1%SDS
0.1×SSC/0.1%SDS
[操作方法]
(1) 将2×SSC湿润的杂交膜放入50ml试管中,再加入5~10ml预杂交液,盖上盖子;
(2)置于杂交炉中,在杂交温度下(比探针Tm值低5~10℃)预杂交10min;
(3)加入适量标记探针,终浓度为1pmol,在杂交温度下,旋转20min;
(4)倾出杂交液,加入30ml 2×SSC/0.1%SDS于杂交温度下漂洗2次,每次5min;
(5)倾出溶液,加入1×SSC/0.1%SDS于37℃漂洗2次,每次5min;
(6)0.1×SSC/0.1%SDS洗2次,每次5min,即可直接用于显色。
2.反向点杂交
[操作方法]
(1)将固定探针的尼龙膜放入50ml试管中,加入适量杂交液,在杂交温度(地高辛68℃,生物素55℃)下预杂交2hr;
(2)将1/10体积标记的PCR产物煮沸5min (或加入等体积的400mmol NaOH,10mmol EDTA 变性5min),冰浴5min;
(3)加入变性的PCR产物,混匀,杂交温度下温育30~120min,漂洗同前。
[试剂与配置]
预杂交液:5×SSC,5×Denhadrt, 0.5%Triton X-100
2×SSC/0.1%SDS
1×SSC/0.1%SDS
0.1×SSC/0.1%SDS
[操作方法]
(1) 将2×SSC湿润的杂交膜放入50ml试管中,再加入5~10ml预杂交液,盖上盖子;
(2)置于杂交炉中,在杂交温度下(比探针Tm值低5~10℃)预杂交10min;
(3)加入适量标记探针,终浓度为1pmol,在杂交温度下,旋转20min;
(4)倾出杂交液,加入30ml 2×SSC/0.1%SDS于杂交温度下漂洗2次,每次5min;
(5)倾出溶液,加入1×SSC/0.1%SDS于37℃漂洗2次,每次5min;
(6)0.1×SSC/0.1%SDS洗2次,每次5min,即可直接用于显色。
2.反向点杂交
[操作方法]
(1)将固定探针的尼龙膜放入50ml试管中,加入适量杂交液,在杂交温度(地高辛68℃,生物素55℃)下预杂交2hr;
(2)将1/10体积标记的PCR产物煮沸5min (或加入等体积的400mmol NaOH,10mmol EDTA 变性5min),冰浴5min;
(3)加入变性的PCR产物,混匀,杂交温度下温育30~120min,漂洗同前。