DNA点杂交

DNA 点杂交

 

l        DNA 斑点印迹的制备

 

预备

1． 冰浴中以 70W 左右的超声波处理基因组 DNA 1min ，用琼脂糖凝胶电泳检测片段大小，这些片段大小均应为 7 ～ 10kb 。

2． 用 TE 缓冲液将 DNA 稀释至 0.5 μ g/ μ l 。

 

 

斑点印迹的制备

1． 加热 5 μ g DNA （在 10 μ l TE 缓冲液中）至 95 ℃ 10min ，冰浴 5min 。用微量离心管短暂离心收集液滴，置冰浴。

2． 裁一张大小合适的滤膜，用铅笔在滤膜上画 1cm 的方格网以标记 DNA 点样的位置。

3． 滤膜先用蒸馏水稍微浸湿，并用 20 × SSC 使其饱和。将膜放在经 20 × SSC 预饱和过的滤纸（ Whatman 3MM ）上。

4． 以 5 μ l 的 DNA 分装样品在滤膜上点样，待前一个样品干燥后再点第二个样品。

5． 将滤膜放在一张干燥的滤纸（ Whatman 3MM ）上稍微晾干，以 5 × SSC 漂洗 5min 。

6． 将 DNA 固定于膜上，硝酸纤维素膜需置 80 ℃真空烤炉 2h 。当尼龙膜仍潮湿时，应用 Saran 包装膜（或任何类似的塑料薄膜）包裹，将 DNA 面朝下置紫外透射仪上，紫外线（ 280mn ）照射 3 ～ 5min ，这时的滤膜已可用于杂交。