DNA斑点杂交系列(二)-实验举例

一、实验原理

用地高辛标记的HCV RNA探针检测HCV RT-PCR产物。

二、实验步骤

1. 处理：

将尼龙膜浸泡于20×SSC中吸足液体后，夹在两层滤纸中37℃烘烤20-30 min。（将尼龙膜置入烤箱后立即进行下一步操作）

2. 变性：

【原理】 使DNA样品变性，即双链DNA→单链DNA。

将待测DNA样品（HCV经RT-PCR扩增产物；HBV的PCR扩增产物作为阴性对照，每组两种样品各10μL）置于PCR仪中100℃加热10min,立即置冰中，并置于-20℃冰箱中骤冷5min。（每一排共三组的样品点在同一张尼龙膜上。）

3. 点样：

【原理】 使样品中的DNA与膜结合牢固。

将上述变性后的样品各2μL点在尼龙膜的毛面上，室温下风干后，于烤箱中120℃烘烤30 min。

4. 预杂交：

【原理】 封闭杂交膜上多余的非特异性DNA结合位点。

将杂交膜封入杂交袋中（每两组的膜背靠背封在一个杂交袋中），做好剪角标记（勿过大）。用1000μL加样器，加入预杂交液（Dig Easy Hyb），每组5mL全部加完，使尼龙膜恰恰漂起即可，若5mL预杂交液不足，可适当补加。除去气泡，置42℃恒温摇床上，轻轻振摇30min-60min. 5. 杂交液制备：用预杂交液将探针按100ng/mL浓度稀释，即为杂交液。 （已准备好）

6. 杂交：

剪开杂交袋一个小角，倾去预杂交液，加入杂交液2-3mL,除去气泡，封口。置50℃恒温摇床上，轻轻振荡过夜。

7. 洗膜：

【原理】洗去未结合的探针，否则会导致过高的本底。

（1）回收杂交液；

（2）室温下，用2×wash solution洗膜两次，每次5min；

（3）将0.1×wash solution预热到50℃洗膜两次，每次15min。

8. 封闭：

取出膜，在含有30mL BufferⅠ的培养皿中浸泡1分钟平衡后，转入30mL BufferⅡ中，室温作用30-60min。

【原理】封闭杂交膜上非特异性的蛋白结合位点。 （在此阶段末期，准备下一步的抗体稀释。稀释方法：加1μL Anti-DIG-AP到10mL BufferⅡ后轻轻混匀，4℃ 可保存12h.）

9. 酶联抗体结合：

将杂交膜封入一个新的杂交袋中，加入3mL Anti-DIG-AP/ BufferⅡ中室温作用30min，经常摇动，使酶联抗体与地高辛结合。

10.洗膜：

（1）取出膜，将膜放入含有30mL BufferⅠ的培养皿中，洗膜两次，每次15min。

【原理】洗去未结合的酶联抗体。

（2）取出膜，将膜放入含有20mL BufferⅢ的培养皿中平衡2min。

11.显色：

（1）将45μL NBT solution和35μL X-Phosphate加入到10mL BufferⅢ中，（注：显色液必需现配现用！）

（2）在10mL新鲜制备的显色底物液中静止避光显色数小时，常在12h内完成显色反应。