离心技术与叶绿体的分离

一、实验目的

　　1 以分离叶绿体为例，掌握离心机的操作技术；

　　2 通过光镜鉴定叶绿体的纯度及了解叶绿体形状；

二、离心技术概述

　　离心技术（centrifugal technique）是根据颗粒在作匀速圆周运动时都会受到一个向外的力而发展起来的一种分离技术。

（一）基本原理

离心力和相对离心力

　　1． 离心力（centrifugal force，Fc）是颗粒在一定角度速度下作圆周运动受到一个向外的力。离心力（Fc）的大小取决于角速度与旋转半径：　

Fc=mω 2 r （1）　　

其中ω是旋转角速度，单位为弧度/秒；r是颗粒离开旋转中心的距离，单位为厘米；m是质量，单位为克。

ω=2л n/60 (2)

　　2．相对离心力（relative centrifugal force，RCF）又称相对离心加速度，是指离心力相当于重力加速度的倍数。在文献中常用“相对离心力”或“数字×g”表示。
　　　　
　　单位是重力加速度g（980厘米/秒2）。式中r为离心转子的半径距离，指离心管的重心至转轴中心间的距离，单位为厘米；g为地球重力加速度（厘米/秒2）；n为转子每分钟的转数（rpm）。

　　为了便于进行转速和相对离心力之间的换算，人们在⑶式的基础上制作了离心力的列线图。见图10-1. 先在离心机半径标尺上取已知的离心半径和在转速标尺上取已知的转速，然后在这两点间取一条直线，与中间RCF标尺上的交叉点，即为相应的相对离心力数值，也是文献中常用的×g。

（二） 离心机的基本分类

　　超速离心机根据用途不同可分成两种基本的类型：制备性超速离心机和分析性超速离心机。制备性离心技术主要用于物质的分离、纯化，可分为一般性制备离心和制备性超速离心。与制备性超速离心不同的是，分析性超速离心主要用于研究生物大分子的沉降特性和结构，而不是专门收集某一特定组份。

分析性超速离心机主要由转子、一套真空系统和一套光学系统所组成。它使用了特殊的分析转子和检测手段，在离心过程中可直接观察颗粒的沉降行为，并可进行扫描和拍照。
　　
（三） 离心机的结构

　　离心机的主要部件为转头、主轴、电动机和传动装置、制动器、外壳和机座。

　　离心机的转头主要有：角度转头（angle-headed rotors）、甩平式水平转头（swing-out rotors）/也称吊桶式转头（swinging bucket rotors）、垂直转头（vertical rotors）。
　　
（四） 离心技术类型

　　离心技术可用于细胞器的分离。分离的过程包括两个主要阶段：破碎细胞和细胞成分的分离。常用离心技术一般包括差速离心法和密度梯度离心法。

1．差速离心法

　　采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒在不同的分离速度和离心时间下分批分离的方法，称为差速离心法。常用于从组织匀浆中分离各种细胞器，见表2-1。

	表2-1 差速离心形成的沉淀（植物）
	沉淀 转速x时间 内 容 物 A 150g x 20min 完整细胞 B 1000g x 20min 细胞核，细胞碎片 C 3000g x 6min 叶绿体 D 10000g x20min 线粒体、溶酶体、微体 E 105000g x120min 微粒体 F 105000g x 20min +0.26%脱氧胆酸纳 核糖体

2．密度梯度离心

　　当不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力场下，在密度梯度介质中，颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直移动到与它们各自的密度恰好相等的位置上形成区带，从而使不同浮力密度的物质得到分离。

　　密度梯度离心主要有两种类型，速率区带离心和等密度梯度离心。

　　等密度梯度离心一般常用CsCl、蔗糖、甘油等做介质。介质梯度不需预先制备，离心时把密度均一的介质液和样品混合后装入离心管，通过离心形成梯度，让颗粒在梯度中进行再分配。此法一般应用于物质的大小相近，而密度差异较大的核酸、亚细胞器和质粒等。