植物叶绿体的分离制备

互联网2013-12-30

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一、原理

研磨叶片得到的匀浆，经过滤、离心可制备叶绿体。叶绿体的被膜比较脆弱，分离叶绿体应在等渗的缓冲溶液中， 0 ～ 4 ℃温度下进行。叶绿体活力会随着离体时间延长而不断下降，因此，分离工作尽可能在短时间内完成。

二、仪器设备及试剂

（一）仪器设备

冰箱， 800 型离心机，扭力天平，显微镜， pH 计，研钵，量筒，移液管，离心管，脱脂纱布等。分离器皿都须在 0 ℃下预冷。

（二）试剂

1. 分离介质：含 0.33 mol/L 山梨醇， 50 mmol/L Tris-HCl （或 Tricine ） pH7.6 ， 5 mmol/L MgCl 2 , 10 mmol/L NaCl ， 2 mmol/L EDTA ， 2 mmol/L 异抗坏血酸钠。配法：称 60 g 山梨醇、 6.06 g Tris 、 1 g MgCl 2 ? 6H 2 O 、 0.6 g NaCl 、 0.77 g EDTA-Na 2 、 0.4 g 异抗坏血酸钠，溶解后用 1 mol/L HCl 调 pH 至 7.6 ，定容至 1000 mL 。

2. 测定介质Ⅰ：含 0.66 mol/L 山梨醇， 2 mmol/L MgCl 2 ， 2 mmol/L MnCl 2 , 4 mmol/L EDTA ， 10 mmol/L 焦磷酸钠， 100 mmol/L Tris-HCl pH7.6 。配法：称 60 g 山梨醇、 0.2 g MgCl 2 ? 6H 2 O 、 0.2 g MnCl 2 ? 4 H 2 O 、 0.75 g EDTA-Na 2 、 2.23 g Na 4 P 2 O 7 ? 10H 2 O 、 6.06 g Tris ，溶解后用 1 mol/L HCl 调 pH 至 7.6 ，定容至 500 mL 。

3. 测定介质Ⅱ：测定介质 I 稀释 1 倍。

三、实验步骤

1. 选用生长健壮，最好是连续几个晴天下生长的菠菜叶片洗净后去除中脉，然后放入 0 ～ 4 ℃冰箱或冰瓶中预冷。

2. 分离介质 30 ～ 50 mL ，置于研钵中，并在冰箱中预冷至出现薄冰。

3. 取冷却的菠菜叶片 10 ～ 20 g ，撕碎后放入研钵，用手工快速研磨 30 ～ 60 s ，注意不要用力过猛，也不必研磨过细，以叶片磨成小块时即可，研磨后将匀浆用两层新纱布过滤。

4. 将滤液装入预冷过的两个离心管，经天平平衡后，用 800 型离心机，以 1000 r/min 离心 2 min 。

5. 倾去上层液，沉淀即为叶绿体。随后每管加 2 mL 分离和测定介质Ⅱ，并用吸管冲散沉淀。叶绿体悬浮液合并后放冰瓶中备用。

6. 用滴管吸取少量叶绿体悬浮液，加少量测定介质Ⅱ稀释，置显微镜（ 400 ～ 600 倍）下，观察叶绿体的形态。

上述是机械法从叶片中分离叶绿体，此外也可从原生质体中分离高活性的叶绿体，具体方法可参照《生物生产力和光合作用测定技术》（科学出版社， 1986 ）一书。

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