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PCR芯片技术操作流程

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1.PCR芯片介绍

实时定量PCR是检测基因表达最灵敏、最可靠的方法。通过在试验过程中,实时监测荧光染料的信号变化可反映出样品中的基因拷贝数,并且实时定量PCR线性范围广(能达到5个数量级),因此可以检测同一样品中表达量极低的基因和表达量很高的基因。

但是,由于实时定量PCR需要制备标准曲线和同时分析内参基因,因而每次实验只能检测少数几个基因的表达水平,若要检测大量基因,则工作量巨大,耗时长久。

通过简单的以及经过优化的实时定量PCR体系,PCR芯片随之开发出来,研究者可以同时研究大量基因,既可以进行某些特别感兴趣的信号通路的研究,也可以作为验证芯片结果的方法,PCR芯片可广泛用于生命科学、生物技术、疾病检测、临床医学和环境检测等领域,是近年生命科学领域的研究热点之一。

2.操作步骤

采用PCR芯片进行实验只需2小时。PCR芯片实验过程:首先将RNA样品反转录为cDNA第一链,作为PCR模板;接着,将模板加入到反应体系(Real-TimeTM SYBR Green PCR Master Mix)中。

在已经固定好基因特异性引物的96孔板各孔中,加入等量的PCR反应体系,进行PCR反应。采用仪器配套的软件计算PCR芯片中的每个基因的循环阈值(Ct)。最后,采用△△Ct方法比较对应的两个样本中同一基因的表达量变化。

通过分析看家基因Ct值的一致性,可确定合适的标准化方法。芯片所设置的对照,可以检测PCR体系中是否存在DNA污染,或者是否有影响反转录或PCR实验步骤的因素存在。

3.技术难度

采用PCR芯片开展研究,技术上的难点是如何在同一次实验中,相同的PCR反应条件下保证不同的基因有相近的扩增效率,并且获得与单个基因实时定量PCR反应相当的灵敏度,特异性和可重复性。

因此首先设计筛选出最佳的候选引物,接着通过实验,在不同反应条件下,检测PCR反应体系与几千条PCR引物的组合,最终获得了优化的引物和PCR反应体系,适应PCR芯片的要求。

4.检测数量

根据一次实验所检测样品数量的多少,可将PCR 芯片分为低通量和高通量 PCR 芯片。低通量PCR 芯片的载体为96 孔或 384 孔 PCR反应板,仅须将制备好的样品cDNA加入相应的反应孔内,在荧光定量PCR 仪上进行扩增即可。

在灵敏度方面,每次扩增仅需400 ng 总 RNA。但低通量PCR 芯片所检测的基因数量有限,而且无法进行多个样品的多个基因的并行检测。

低通量PCR 芯片使用时和通常的定量 PCR 操作步骤相同,即从待检的生物样品(细胞、组织、血液等)中提取总RNA 或分离出 mRNA→经反转录形成cDNA→将所得的 cDNA 直接等量加入含有相应待检测基因引物的孔中→加入PCR mix→在荧光定量PCR 仪上进行 PCR 定量检测→数据分析。

高通量PCR 芯片是在固相载体上固定有成百上千个基因的特异性引物,并且可同时检测高达成百上千个样品,达到同时并行检测多个样品的多个基因表达的能力。因此,具有检测通量高、耗时短和样品用量少的优点。

目前,由Applied Biosystems 公司研制的OpenArray SystemFluidigm 公司开发的BioMarkSystem将荧光定量PCR 技术与高通量芯片技术相结合,属于高通量PCR 芯片,但这些芯片必须在特定的定量PCR 仪器上使用进行。

5.优势

PCR芯片与常规PCR相比:

1. 整体性,PCR芯片操作系统采用多基因扩增、结果分析一体化,操作简便;传统的PCR采用单基因扩增及结果分析,操作繁琐;

2. 时间,PCR芯片检测多个基因的时间是过去PCR检测单个基因的时间;

3. 试剂,传统PCR对试剂用量有要求,15微升以下就很难得到理想的扩增结果,PCR芯片可以扩增10微升以下的样品,这相应减少了试剂如Taq酶的用量,节省了实验经费也减少了废液污染。

因此,与常规的PCR扩增技术相比,PCR芯片具有反应体积小、反应速度快、操作简便、价格低、样品用量少、无污染、节省试验成本、便于集成化、结果可靠的优点。

6.应用

使用PCR芯片技术进行基因表达(信号通路或多个相关基因)的检测,已普遍用于生命科学研究的多个领域,如疾病发病机制研究,并且PCR 芯片作为一种快速、准确的技术手段,可应用于药物机理研究中。

7.发展方向

PCR芯片不仅成本低,而且试样、试剂、人力三者消耗量均低, 速度也快, 灵敏度高。作为DNA分析的重要工序PCR,更是现代生物、医药不可或缺的部分,其没备的集成化,如样品预处理系统、分离系统以及检测系统等的集成使PCR芯片在生命科学、生物技术、疾病检测、临床医学和环境检测等领域继续发挥重要作用。

8.启因服务技术

启因生物,自建优化的引物数据库,针对客户的需求,可以根据客户要求,任意选择基因,启因生物都可以进行引物反应条件的优化,从而达到同时检测多个基因的目的。因此PCR芯片技术服务利用就是SYBR Green荧光定量PCR技术,并在96或384孔板上同时检测一个信号通路或者一种疾病相关的84或372个基因的表达水平。

9.PCR芯片数据分析

1)384孔板展示区:

点击孔板列表中的某一项目时,中间的图像展示界面会出现384孔板,每一孔代表检测的一个基因,每个孔都有不同的颜色显示,越偏红的孔代表此基因的Ct值越高,越偏绿色的说明此孔基因的Ct值越低,颜色相近的孔说明这些孔的基因Ct值差异不大;有些孔板的孔是灰色,说明此孔没有基因。可以检测任意数目的样本和基因;

2)散点图多基因分析

在实验中,我们经常用到对两个样品的分析,因此就涉及到两个样品的Ct相关性分析,结果图表示两个样品中多个基因的Ct值情况,靠近X或Y坐标轴的说明此基因在某一样品中的表达较高,而处于中间的,即X/Y=1时,说明此基因在这两个样品中的表达无差异。

3)标准品聚类分析

此种分析方式适用于多个样品多个基因的同时展示,类似于基因芯片,通过选择数据和对颜色、宽高度设置,一张关于qPCR结果的热点图完整的显示出来,而通过比较不同的格子,可以分析出表达是否存有差异,颜色相近的表示没有变化,颜色差异越大说明表达差异越大;


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