PCR技术操作程序与优化方法

典型的PCR操作

在此处仅列出—般PCR操作过程，具体影响因素的优化将在本章第二节讨论，每一个具体操作前都需进行必要的优化。

一、 试剂

(1)引物根据待扩增DNA不同，引物亦不同，引物的设计见本章第三节。

(2)耐热DNA聚合酶：此酶是从耐热细菌中分离出来的，能耐受高温(93—100c)，不同耐热DNA聚合酶的特性详见本章第4节。 Perkin—E1mer—cetus公司、N、F、Bio1ab、PharMacia公司、国内华美公司、复旦．大学和中国医学科学院友谊公司等均有商品供应。

(3)10x PCR缓冲液： 500mm01／L KCl； 100mmol／L Tris一HCl(pH8.4， 20c)，150mmol／L MgCl2， lmg／m1明胶。

(4)5mmo1／L dNTP贮备液：将dATP，dCTP，dGTPT和dTTP钠盐各100mg合并，加3m1灭菌去离子水溶解，用NaoH调pH至中性，分装每份300v1， - 20℃保存，dNTP浓度最好用uv吸收法精确测定。另外。现在已有中性dNTP溶液商品供应(Sigma公司和Pharmacia公司等)。

(5)标本处理试剂：不同标本所需试剂不同，根据具体情况而定〔见本章第6节)

二、操作程序

利用PcR扩增的操作程序基本相同，只是根据引物与靶序列的不同，选择不同的反应体系与循环参数，基本的操作是将PcR必需反应成分加入一微量离心管中，然后置于一定的循环参数条件下进行循环扩增。每个实验室或每个人都有不同的操作习惯，但需遵守一定的操作规范。我们推荐下述操作程序，因这样操作可最大程度地增加反应的成功率。

(1)向一微量离心管中依次加入：

ddH2 O补至终体积(终体积50~100ul)

10 x PCR缓冲液 1／10体积

dNTP 各200umol／L

引物 各1umol／L

DNA模板

混匀后，离心15s使反应成分集于管底。

(2)加石蜡油50—100ul于反应液表面以防蒸发。置反应管于97c变性7min(染色体DNA)或5min(质粒DNA)。

(3)冷至延伸温度时，加入1—5U Taq DNA聚合酶，在此温度作用1min。

(4)于变性温度下使模板DNA变性适当时间。

(5)在复性温度下使引物与模板杂交一定时间。

(6)在延伸温度下使复性的引物延伸合适的时间。

(7)重复(4)一(6)步25—30次。每次即为一个PcR循环。

(8)微量琼脂德凝胶电泳检查扩增产物(见本章第7节)。

上述过程可以用PcR自动热循环仪进行，也可以设定3个恒温水浴锅手工操作。