制备单克隆抗体杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化培养

互联网2010-12-02

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制备单克隆抗体杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化培养

1、杂交瘤阳性克隆的筛选杂交瘤细胞在HAT培养液中生长形成克隆后，其中仅少数是分泌预定特异性McAb的细胞，而且多数培养孔中有多个克隆生长，分泌的抗体也可能不同，因此，必须进行筛选和克隆化。

常用方法有酶联免疫吸附试验(ELISA)，间接血凝试验(PHA)，放射免疫测定(RIA)、直接和间接荧光抗体技术(DFA、IFA)以及免疫酶斑点试验等。如测定针对细胞表面抗原的McAb可用细胞毒试验，而测定可溶性抗原的McAb多用ELISA。

2、首先初筛出能分泌与预定抗原起反应的McAb杂交瘤细胞，再进一步从中筛选出有预定特异性的杂交瘤细胞，然后选出可供实际应用，具有能稳定生长和有功能特性的细胞克隆。而且应尽量多选数株细胞，以保证有足够的候选株供实际应用。

3、克隆化技术为了防止无关克隆的过度生长，对阳性孔需进一步克隆化。常用的克隆方法有：有限稀释法、软琼脂法、直接挑取法及荧光激活细胞分离仪(FACS)分离法。以前两种方法最为常用。

（1）有限稀释法：将需要再克隆的细胞株自培养孔内吸出并作细胞计数，计出1ml的细胞数。用HT培养液稀释，使细胞浓度为50～60个/ml，于96孔培养板中每孔加0.1ml(5～6个细胞/孔)。接种两排，剩余细胞悬液用HT培养液作倍比稀释，再接种两排，如此类推，直至使每孔含0.5～1个细胞。

培养7～10d后，选择单个克隆生长的阳性孔再一次进行克隆。一般需要如此重复3～5次，直至达100％阳性孔率时即可，以确保抗体由单个克隆所产生。本法简便、效果好，已被广泛应用。

（2）软琼脂法：是在琼脂糖凝胶半固体培养液中使细胞增殖的方法。将杂交瘤细胞培养在软琼脂板上，待单个细胞形成群落后，再用吸管吸出，并轻轻吸上和吹下而打碎团块。将吸出的细胞移入小孔中继续培养。用这种方法可以吸出大量克隆进行增殖和分析。

（3）显微挑选法：是以显微操作术用微细吸管将单个克隆细胞选出，分别进行培养。

（4）FACS法：利用McAb、免疫荧光和激光原理对细胞进行定性或定量流式细胞光度分析与分离。分离后将选出的杂交瘤细胞放入96孔板中培养。