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骨髓细胞染色体标本的制备及观察

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用骨髓细胞进行染色体标本的制备,不需要体外培养,因此,不需无菌操作,整个过程所需时间短,方法比较简单,一般实验室均可进行。

一、制作方法

1、取样

将25g体重的蟾蜍用颈椎脱臼法杀死。杀死前2~3h,腹腔注射0.1%浓度的秋水仙素溶液(注射量以4μg/g体重计算)。杀死后,取每侧的股骨和肱骨各一根,去净外面的肌肉组织,剪去两头,用注射针头吸入一些生理盐水,将骨髓冲至一小培养皿中,反复几次,将全部冲出物吸入离心管内离心(1000转/min)8min。

2、低渗处理

吸去上清液,加入在37℃中预热的0.4%KCl溶液至5ml,用吸管轻轻吸动,使细胞松散,在37℃温度,低渗20min,离心8min(100转/min),在离心前加入1ml固定液作预处固定,防止细胞松散。

3、固定

吸去上清液,沾管壁加入甲醇∶冰醋酸=3∶1的的固定液5ml,固定5min后,用吸管将沉淀物轻轻打匀,再继续固定30min离心8min(100转/min)。 吸去上清液,再加固定液固定一次,用吸管打散静止15~20min,离心8min(1000转/min)吸去上清液,留沉淀物,再加少量固定液混匀,即可制片。

4、 制片及染色

从冰箱中取出预冷玻片,平置在手中,然后,将标本混匀液从一定的高处滴下,并立即用口吹散,在酒精灯上加热干燥。干燥后,将稀释10倍的Giemsa染液(用前稀释)滴于玻片上,染色20~30min,流水冲洗几秒钟,在酒精灯上干燥后,即可置于显微镜下观察。

二、观察

在高倍显微镜下观察蟾蜍骨髓淋巴细胞的染色体。我们可能看到有11对(2n=2×11=22)等臂的染色单体,每一条都呈V字形。基本形态如下图。在显微镜下,染成红色的为染色体和着丝粒,染成浅蓝色的为细胞质,染色单体没有着丝缢痕和次缢痕。

三、Giemsa 染液的配制

1、Giemsa原液的配制(1ml)

Giemsa粉剂0.5g、甘油(A·R)33ml、甲醇(不含丙酮)(A·R)33ml。 将少量甘油中加入粉剂,用研钵磨至无颗粒为止,再加入全部甘油33ml,放56℃温箱中2h溶化后加甲醇33ml,摇匀后保存于棕色瓶中,用时稀释10倍。

2、磷酸缓冲液(pH=7)的配制

取1/15M磷酸二氢钾溶液38.8ml和1/15M磷酸氢二钠溶液61.2ml混合后,即可得pH=7的磷酸缓冲

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