免疫组织化学技术:染色步骤

一、免疫荧光法

１．直接法

（1）冰冻切片、涂片、印片或单层 细胞培养 物按要求进行固定，石蜡切片常规脱蜡后用酶消化处理，然后水化，用0.01mol/L PH7.2---7.4PBS洗5分钟，冷风吹干，放入湿盒中。

（2）滴加经稀释的荧光抗体，37℃ 30-60分钟或4℃ 过夜（3）PBS 洗2次，蒸馏水洗1次

（4）50%甘油缓冲液封片

（5）荧光显微镜下检查

（6）对照染色

①阳性对照，用已经证实的含有靶抗原的组织切片与待检标本同样处理，结果应为阳性。

②阴性对照，用确知不存在靶抗原的组织切片与待检标本同样处理，结果应为阴性。

③空白对照，用免去特异性抗体或用PBS替代特异性抗体，结果应为阴性。

④抑制试验，将标记抗体(例荧光抗体)和未标记的抗体或血清等量混合后，按上述步骤处理切片，结果应为阴性（一步法）。

或将待检切片两张，一张加未标记特异性血清，另一张加未标记同种正常血清，孵育后冲洗，再加入标记的特异性血清（例如特异性荧光标记抗体），加了未标记特异性血清的切片因抗原抗休已结合，故染色被抑制，呈阴性结果，而加同种正常血清的切片则呈阳性反应（二步法）。

对照染色非常重要，开始试验时应做全面对照，每次试验时应做阳性和阴性对照。

2．间接法

（1）标本处理同直接法。

（2）滴加适当稀释的特异性抗体于标本上，置湿盒中，３７℃ ３０～６０分钟或４℃过夜。

（3）滴加适当稀释的间接荧光抗体，置湿盒中，３７℃ ３０～６０分钟。

（５）ＰＢＳ洗２次，双蒸水洗１次。

（６）甘油缓冲液封片，荧光显微镜下观察。

（７）对照染色：可用空白对照和阴性对照等。

３．补体法

（１）标本处理同直接法。

（２）滴加适当稀释的特异性抗体及补体的等量混合液，置湿盒中，３７℃３０分钟，ＰＢＳ洗３次。

（３）滴加适当稀释的抗补体荧光抗体，置理盒中，３７℃ ３０分钟。ＰＢＳ洗２次，蒸馏水洗１次。

（４）甘油缓冲液封片。

（５）对照染色，可作正常血清替代，灭活补体对照即经５６℃ ３０分钟灭活处理后，将灭活的补体与特异性抗体等量混合，进行染色，结果均应阴性。

４．双重色疫荧光法

在同一标本上有两种抗原需要直接显示时，可用不同的荧光素分别标记抗体进行染色。

一步法双染色：先将两种标记抗体按适当比例混合，按直接法步骤进行。

二步法双染色：先用一个标记抗体孵育，不必洗，再用另一个标记抗体孵育，按间接法步骤进行。

５．注意事项

（１）免疫荧光法最适宜进行冰冻切片的染色，因为此种切片一般抗原保存得较好。若是石蜡切片则应首先选用免疫酶法等染色技术。

（2）使用商品的荧光标记抗体，在进行染色前应作抗体效价的测定，找出合适的稀释度后再进行成批染色。一般而言，在阳性物质发出明亮荧光而背景又较暗时的稀释度是较为合适的。高稀释度的荧光抗体可以减少非特异性着色使染色结果更具特异性，但稀释度过高会导致假阴性的出现。

低稀释度的荧光抗体使结果较易观察，但会带来非特异性的着色，甚至出现假阳性的结果。

（3）非特异荧光的消除。非特异性荧光的消除方法较多。一般而言，冰冻切片的非特异性荧光较强，石蜡切片的非特异性荧光较弱。常用的方法有

①先用非免疫血清如10％牛血清等处理切片，然后再行荧光染色。

②用小鼠相应组织的干粉吸收荧光抗体中的非特异性成分。

③选择合适的稀释度和切片。

④选用高特异性和高效价的荧光抗体。

（4）洗涤要彻底。每道程序都有用蒸馏水或缓冲液洗涤以清除残留在切片中的 试剂 ，以达到特异着色的目的。洗涤时不论是冲洗还是振荡洗涤，其基本原则是要达到洗涤干净的目的，或者说充分稀释上一道程序中的 试剂 ，使其含量降至最低。

一般只要有足够的时间，以静置廷长每次洗涤时间为宜，这是防止脱片的较好办法。洗涤液的PH值应为7.2~7.4之间，过高过低的不利于染色过程，尤其是在偏碱的PH值条件下。

（5）孵育时间与温度。免疫荧光法一般孵育温度在37℃，时间为20——30分钟时是最佳时间与温度。当然，也与抗体的效价，组织抗原的含量与部位，切片的厚度等有关。