膜在分子诊断学中的应用

随着分子诊断学的不断发展，有人认为膜将逐渐失宠。然而，事实绝非如此。

在体外诊断(IVD)的发展过程中，膜材料和微孔材料一直长期占据中心地位。硝酸纤维、尼龙等材料制作成膜，这些膜的使用促进了以抗原抗体相互作用为基础的免疫检测的发展，并使这些测定获得了今天所拥有的市场优势地位。膜的使用也使免疫诊断学向侧流照护点检验的改进成为可能，比如今天人们所熟悉的家用孕检工具形式。

但是，随着分子诊断学逐渐商业化发展，一些分析家认为膜的作用必将逐渐消失。他们认为，基于抗原抗体相互作用的免疫检测将会被新兴的以核酸为靶点的分子诊断学所代替，在此过程中，一些未来技术，如微型制造的DNA芯片，将会代替膜而被使用。

图1 分子生物学和诊断学中尼龙6,6膜的应用

然而，鉴于目前趋势，很难说上述预测会成为现实。事实上，随着分子诊断学进入市场，膜材料和微孔材料的使用更有可能不断增加。膜在分子诊断学领域已有令人瞩目的成就史，包括从实验室分子生物学研究到商业诊断学的重大转变。

例如，当首个聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳发展起来时，人们就选择硝酸纤维膜作为结合转移蛋白的介质。1,2 DNA印迹发展时，硝酸纤维膜也是最初被使用的膜之一。在此应用中，尼龙6,6膜凭借良好的DNA稳定性、灵敏的免疫检测特性和对反复探针损伤的耐受性，现已广泛代替了硝酸纤维膜。3,4

如今，研究者们已把膜材料和微孔材料应用于分子领域，例如，DNA检测用于诊断和高通量筛选（HTS）模式用于药物研发。将来，膜可能会远远超出最初设想的应用领域，而应用于其他领域。

本文调查了膜特别适用的一些关键分子应用，并标注了每个过程中适用的膜（见表I）。

样本制备

广义上，标本制备指复合标本的选择性分离，或指为后续检验而制备特殊分析物或成分。标本制备一般包括全血中血浆分离、血浆中肝素去除、DNA分离、白细胞制备。许多正在发展的新诊断技术需要以某种方式选择性制备分析物。

标本制备的过程中，研究者经常要用到离心方法。然而，离心虽适用于实验室研究，但不易于自动化。而微孔膜适用于自动化处理和检测方案，并且其中一些类型可用于全血中血浆分离、DNA或白细胞制备，以用于进一步检测。

许多微孔材料可用于全血中血浆分离。这些材料创造性地用于照护点免疫诊断中少量血液的快速血浆分离，可作为血液分离的非离心方法。

实际上，血浆容易通过毛细作用从一些（而非所有）血液分离材料移动到多种固体载体上，因此这些分离材料可用于标本制备来检测细菌、胆固醇和多种血浆、胆固醇和多种血浆分析物，也可用于临床自动化筛查细胞外病毒，如肝炎病毒和HIV等。

图2 HEMASEP膜在全血制备病毒标本中的应用

初步实验显示，HEMASEP V 血液分离介质可用于细胞外病毒的非离心制备方法。此概念很简单。血液分离材料与低蛋白质键结介质接触，使血浆迅速与全血分离（见图2）。然后血浆转移到另外的低蛋白质键结固体载体，并加入到聚合酶链式反应（PCR）工具以在平面区域中进行处理。

实验中，感染有M13病毒的全血应用HEMASEP V介质，使血浆成分移动到多种二级低蛋白质键结固体载体上，然后再进行PCR扩增。结果显示，HEMASEP V介质可用于制备细胞外病毒DNA来进行扩增，而无须采用离心方法（见图3）。

图3 与HEMASEP V介质接触的诊断介质直接进行PCR扩增

1:25的稀释溶液加入40ml新鲜人血，滴到HEMASEP V介质上。血浆带上3cm长的介质直接进行PCR扩增（d）， 或者一种诊断膜与HEMASEP V接触来收集血浆。二级介质包括 Premium Release膜（e）、LoProsorb介质（f）和LoProdyne LP 尼龙 6,6 膜 (g)。含有分离血浆的膜标本（3mm）也直接进行PCR扩增。PCR反应池：(a) M13 DNA, 100 ng ； (b) 溶菌液， 109 particles; (c) 无DNA或抗菌素。

在分离膜上进行PCR扩增的思想是非同一般的。许多文章中记载有评价此种方法的研究实例，其中成功的研究似乎很大程度上依赖于所使用膜的种类以及膜是否可阻滞扩增反应。

其他膜适用于从全血中分离白细胞以进行进一步分析。白细胞减数分裂过滤器广泛应用于生物制药，同样地，这些膜材料能够选择性结合白细胞，而使大多数红细胞顺畅通过。例如，白细胞吸附介质是一种平板纤维材料，可从全血中去除约90%的白细胞。此材料垂直叠放可提高白细胞的去除效率。

选择性结合白细胞的固体载体还可用于从全血标本中制备基因组DNA,，也可用于白细胞表面受体的检测。另外，细胞巨化病毒等等许多病毒主要位于白细胞内，白细胞结合固体载体可捕捉白细胞，以对细胞内病毒作进一步分析。

以膜为基础的DNA检测

以DNA为基础的分子检测中，多种理由都要求我们要利用膜。除了普遍易得性以及公认的性能记录外，膜还具有其他培养基无法可比的特性，包括：更快的检测结果、简化的筛查方法、与多种公认DNA和蛋白质检测系统的协调性。

目前，采用膜作为固体载体的分子检测以多种形式存在。例如，Orgenic 公司（Yavne,以色列）向市场推出了利用硝酸纤维膜的纸色谱杂交检测（PACHA）。这种快速检测利用了许多靶向特异的寡核苷酸探针，这些探针如条纹一样固定于膜上。

DNA经过PCR扩增，生物素化核苷酸在此反应中被整合进入。然后，生物素化的DNA应用于膜上，通过毛细作用与其上固定的探针相作用，在探针条纹处，生物素化DNA与相应的探针分子发生序列特异性杂交，而非杂交探针迁移游过探针条纹处。

最后，链亲和素碱性磷酸酶轭合物被加入，信号从探针条纹处产生。

另一应用中，一公司以浸量尺方式，研究了利用DNA探针检测食品传播病菌的可能性。尽管此研究利用塑料条作为固体载体，但如果利用膜作为固体载体，也会同样有效。此检测方法利用的是一种混合探针，这种混合探针包含识别特殊病原的DNA序列和单个多聚脱氧核苷酸的末端，此末端可识别多聚脱氧核苷酸覆盖的固体载体。

DNA检测

高密度微阵列正越来越广泛的应用于DNA测序、遗传学分析和药物研发。13尽管制造商正采用微型制造的DNA芯片等替代检测方法，但膜也同样在被使用。尼龙膜用于DNA序列杂交，也作为固相载体用于细菌菌落或组织特异性mRNA检测。14一些膜最初在免疫检测中作为横向流动材料应用，现在也正作为固体载体用于新的检测技术。15

越来越多公司开始提供商用DNA检测和膜上的细菌纯系“图书馆”。这些新产品大多以标准杂交原则为基础。此类基于膜的商用检测法可用于基因表达分析、疾病机制研究或药物研发中有用化合物的鉴定。例如，克隆技术实验室公司（PaloAlto, CA）提供了基于膜的核酸检测法，以用于基因表达的检测。这种分析法利用了正电性的尼龙膜作为载体。此领域的其他公司中，Research Genetics (Huntsville, AL)提供了一个5╳7膜上超过5000个基因的高密度检测法，而Display System Biotech (Vista, CA) 提供了以膜为基础的基因表达探针检测法。

图4 分子应用中三种不同化学替代物制作的Biodyne Plus膜的适用性在384点DNA检测中的表现。此检测中，200pg的 Hind III DNA加入Biodyne Plus膜上的384点阵。根据说明，50ng/mlDIG标记的探针在膜上发生杂交。之后，将膜冲洗、阻断，与结合碱性磷酸酶的抗DIG抗体一起孵育。利用三种不同碱性磷酸酶替代物产生了信号：（a）BCIP/NBT ，彩色信号直接显示于膜上； (b) 基于二氧环丁烷的化学发光替代物，信号通过胶片显影显示；(c) 沉降的化学发光替代物，信号通过分子动力学荧光显影仪荧光扫描显示。

如何正确选膜？

许多公司将膜应用于DNA测序或药物研发，但几乎没有公司改善其设计参数，以致不能将膜的使用超出硝酸纤维和信号检测的放射性方法。然而，为优化产品性能，制造商须确保使用合适的膜和检测方法。例如，现有的尼龙6，6膜可通过比色法、荧光法和化学发光法用于DNA检测（见图4）。16

图5 尼龙6，6膜的不同表面化学组成可导致不同的信号检测质量和自然干扰水平。注意膜（b）和膜（c）之间的区别，他们是由不同制成的带正电的材料（分别是Biodyne Plus和 Biodyne B）。(a)Biodyne A, (d)Biodyne C,和(e)LoProdyne LP 也在图中显示。

以核酸为基础的分子检测设计时，若要采用固体载体，尼龙6，6膜将是不错的选择。然而，并非所有的尼龙膜都相同。尼龙配方和生产过程不同，导致膜在同一检测条件下的表现不同。例如，尽管Biodyne B膜和Biodyne Plus膜都带正电，但由于生产方法不同，一个显示极好的敏感性和低自然干扰性，而另一个无此特性而不值得利用（见图5）。其他尼龙6，6膜因有不同的表面化学组成而使信噪比不同。这些不同使人们很难从一种尼龙膜推断另一种的数据及协议。

产品设计者将膜的选择和DNA检测草案完善后，可以获得更好性能的产品。

下面是在选择分子应用膜时开发者应考虑的几个方面。

表 II. 分子诊断学中常见协议和应用，以及相应的膜类型、摸的主要卖主。

尼龙种类包含所有不同配方和加工过程的产品，不同种类会导致不同的检测结果。

图6蛋白质与尼龙6,6膜结合，显示蛋白与膜之间的关系

表面化学组成 当前尼龙膜的一个主要优点是其表面组成的多样性。中性膜、正电性膜、负电性膜在分子诊断学中都能找到合适的应用。为确定何种表面化学组成是最合适的，开发商既须考虑特定协议的要求，又要考虑将要采用的DNA检测方法的要求。通常，检测过程中试剂间复杂的相互作用决定着开发者如何选择膜的表面电性（见表II）。

尽管人们使用“表面化学组成”这一术语，化学组成成分其实散布于膜的整个三维晶格。另外，电荷是膜上不可缺少的，不会被冲洗掉。通常认为，硝酸纤维膜经过疏水作用与分子结合，而尼龙6，6膜是通过离子作用或静电作用。23然而，实际上尼龙膜的结合机制更加复杂。此膜的电荷组成虽有作用，但与尼龙膜结合主要是凭借疏水作用（见图6）。其机制基于以下事实：相似条件下，正电性、负电性和中性的尼龙6，6膜结合DNA或蛋白质的数量几乎相等。

自动化过程中的耐用性 一些尼龙6，6膜既以载体形式生产，又以非载体形式生产。载体形式更加耐用，因此更适合须经历附加过程或装配的应用，也适用于自动化检测过程。与层压材料不同的是，其载体位于内部，尼龙材料位于表面（见图7）。这使膜更加耐用，检测分析时也不会显露载体，并且膜没有极性，两个表面都可被利用。

检测敏感性 随着非放射性检测技术的发展，放射性方法在分子诊断学中的使用正逐渐减少。目前，三个最重要的非放射性检测技术是色谱法、化学发光法和荧光法。

放射性能否取代非放射性方法很大程度上依赖于新技术提供相似敏感性的能力。如今，基于膜的DNA检测利用化学发光法或荧光法、信号放大试剂，可获得与放射性检测相似的检测水平。特别是化学发光法，在临床诊断学中越来越被人们所接受，在抗体、维生素等等的筛查中都应用的越来越多。24

图7 Biodyne尼龙6，6膜

微结构扫描电镜图

完善信号检测的关键是将所使用的膜的类型与可能提供最好结果的检测方法相匹配。与合适的检测方法联合使用时，尼龙膜将提供优良的信噪比（高信号、低自然干扰）。例如，在极度严格的司法领域，联邦实验室将一种中性尼龙膜用于非放射性的化学发光法检测，但却发现一种正电性的尼龙膜与放射性检测方法共同使用效果良好。25–27

新型膜的发展

现有膜技术为分子诊断学和HTS应用的发展提供了广泛空间。然而，随着这些发展领域的成熟，人们须开发新型膜以适应发展的特殊要求。

在分子诊断学领域，与非放射性检测方法一起应用时，膜须具有完善的检测能力。新型亲和分离膜也应加以开发，以用于样本制备中选择性加强或清除靶分子。

HTS实验中，筛选化合物的数量仍不断增加，这使对更高密度检测的需求也不断增加。为满足这一需求，未来膜应向更优的可视性发展，以使点密度的增大成为可能。用于化学发光法和荧光法检测系统时，这种材料须提高其信噪比。

结论

随着DNA检测技术竞争进入市场，开发者不应忽视膜材料和微孔材料的潜力。这些材料在DNA、蛋白质的实验室检测分析方面，都已有成功应用的记录，并且DNA检测时膜性能稳定、价格低廉，这些都保证了微孔材料将在分子诊断学和HTS应用领域能更多地被使用。

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作者简介：Jason M. Alter博士是Pall 公司 (Port Washington, NY)旗下的Pall Specialty Materials公司销售副总裁。作者感谢Andrew Dubitsky提供的nylon 6,6上的DNA检测结果照片。

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