Pyrosequencing在分子诊断方面的应用
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以下方案指出了以前用于炭疽热细菌鉴定方案的局限性，这些方案有抗体检测的诊断方法， 16S rRNA基因的序列分析， DNA杂交， gamma phage sensitivity tests和carbohydrate profiles等。该方案肯定了利用pyrosequencing鉴定细菌的优势。
鉴定炭疽热细菌Bacillus anthracis的最新方案
利用PSQ 96 DNA分析系统，基于DNA序列测定的炭疽热细菌的菌种鉴定
及其致病力鉴定
土壤细菌Bacillus anthracis (B.anthracis)是引起炭疽热严重感染的病原细菌。从接触病原体到症状最初出现的感染发展过程一般为1到6天。如果确认受到B.anthracis攻击，利用抗生素或解毒剂可以防治其感染，因此快速鉴定病原微生物种类和其致病力状态具有很重要的意义。在接触病原体的起初24-48小时内摄入抗生素可以防治其传染。抗体检测的诊断方法可能比病情进展稍微滞后，而在这个时期的防治可能是失败的。
被称为Ba813的一段DNA序列是B.anthracis的一个特异染色体标记，是B.anthracis区别于与其紧密相关的其他土壤杆菌种的标志。 Ba813长度为277bp，在染色体上为单拷贝。16S rRNA基因的序列分析被用于细菌分型，但不能用来分析B.anthracis，因为B.anthracis与B.cereus具有一样的16S rRNA序列。
B.anthracis的致病菌株有两个质粒，pXO1含炭疽热毒素产生的基因( lef， cya， pag)。 pXO2编码包装和孢子形成所必须的产物。目前，通过DNA杂交来检测这些特异致病因子是鉴定B.anthracis的主要手段。然而由于缺少一个或两个质粒的非致病菌株可能来自致病菌株，因此此方法即不完全可靠又不快速。其他费时的方法包括gamma phage sensitivity tests和carbohydrate profiles。
本研究试图建立新的鉴定B.anthracis及其致病状态的方法，即利用Pyrosequencing™技术分析PCR扩增的Ba813的20bp的序列来鉴定B.anthracis，并通过分析lef和位于pXO2的cap的基因序列来确定B.anthracis的致病状态。
提取B.anthracis的质粒和染色体DNA，设计三对引物，分别扩增Ba813中的129 bp， lef基因的177 bp， cap基因的127 bp。每对引物的其中一条用生物素标记。
采用streptavidin coated beads (Streptavidin Sepharose™ HP， Amersham Biosciences AB， Sweden)和PSQ™ 96 Sample Preparation Kit (Pyrosequencing AB) 及其相关方法将PCR双链分离，转移至PSQ 96 SQA Plate的含生物素引物的单链PCR产物和测序引物退火。
利用测序试剂盒SQA Reagent Kits (Pyrosequencing AB)和PSQ 96 DNA分析系统进行序列分析，结果用SQA软件进行分析。
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通过对来自Swedish Defence Research Agency的13个B.anthracis分离物的Ba813的20bp片段的序列分析，其中12个分离物被明确鉴定为B.anthracis (Table 1， Fig。1)，另外一个由于PCR的失败而被排除。同时也检测了质粒(Table 1， Fig。2-3)。 SQA软件精确分析了11个分离物的核苷酸序列(大于等于20bp)。其中一个序列的AA被错读为AAA，但这并不影响对细菌的鉴定。菌株鉴定的序列分析的精确度为99。6% (Table 2)，而致病力鉴定的序列分析的精确度为100% (Table 2)。 因此，利用PCR和Pyrosequencing™技术的序列分析提供了一个可靠的鉴定Bacillus anthracis及其致病力的快速简单的方法。与其他方法相比，此方法速度快，几个小时出结果，而且结果精确。 |
References
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二．细菌分型：Bordetella pertussis（百日咳杆菌）和parapertussis（副百日咳杆菌）
百日咳(pertussis,whooping cough)是由百日咳杆菌所致的急性呼吸道传染病。婴幼儿多见。临床上以阵发性痉挛性咳嗽、鸡鸣样吸气吼声为特征。病程可长达2～3月，故名百日咳。百日咳可以通过因咳嗽而产生的飞沫传染，并且在已接种疫苗的人群中仍可能重新出现。
百日咳杆菌属鲍特杆菌属(Bordetella)，长约1.0～1.5μm，宽为0.3～0.5μm。革兰染色阴性，两端着色较深。有荚膜，无鞭毛。副百日咳杆菌也属鲍特杆菌属，其形态与百日咳相似，亦可引起百日咳症状，但两者间无交叉免疫。因此，在百日咳的诊断中，区分不同类型的鲍特杆菌是十分重要的。
通过对B.pertussis亚单元1的研究，发现它的多态性位点存在着四种不同的等位基因。使用PyrosequencingTM技术，存在于13bp范围内的三个可变位点可以通过一次分析被检测，从而确定它的基因型。同时也处于同一个13bp范围内的第四个多态性位点也可同时被检测，从而在一次反应中区分B.pertussis和B.parapertussis。
方法
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PCR扩增
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鲍特杆菌由Swedish Institute for Infectious Disease Control提供。由单克隆准备细菌DNA样本。一段118bp来自toxin S1基因（position 620 to 738）的片段，在50ul的反应体积，包含1.5mM MgCl2，Taq polymerase（Perkin Elmer）和各0.3uM 5’-CCA ATC CCA ACC CCT ACA C-3’、5’-CAT GGC CTC GGA GCT TTC-3’两种PCR引物。其中引物5’-CCA ATC CCA ACC CCT ACA C-3’标记有生物素，以便于下一步与链亲和素包被的Beads相孵育。PCR条件如下：150 sec 96℃,40x (96℃ for 20sec, 48℃ for 5sec, 72℃ for 30sec), followed by 5 minutes at 72℃ before cooling to 4℃。
为Pyrosequencing™分析准备样本
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根据PSQ™ 96Sample Preparation Kit (Pyrosequencing AB)所提供的标准的实验法案，将标记有生物素的PCR产物与链亲和素包被的Beads（Sepharose™ HP,
Amersham Biosciences Ltd.）相孵育。孵育后将Beads移入一个Filter Plate中，通过真空过滤出去液体（MultiScreen™ Resist Vacuum Manifold, Millipore Inc.）。单链模板被转移到一个PSQ 96 Plate中，并且与16pmol的测序引物5’-GCC ATG CAA GCG CC-3’（反向）在60℃下退火5分钟，然后冷却到室温。退火后，为了在Pyrogram™中更加容易分辨结果，再加入2.2ug单链DNA聚合蛋白（SSB, Amersham Biosciences）。
使用Pyrosequencing™技术进行序列分析：
样品使用带有SQA软件的PSQ 96系统和SQA试剂盒（Pyrosequencing AB）进行序列分析。
结果：
设计序列分析以涵盖toxin S1的一个短的区域，并区分B.pertussis的四个不同的等位基因。分离出的包含有B.parapertussis也可以被分辨出来（见图1）。种类区分进行了来自704个不同的临床病例的DNA样本。在进行Pyrosequencing检测前，其中的142个病例样本进行了Sanger测序的方法分辨基因型，Pyrosequencing的检测结果与先前的测序结果完全吻合。此外，未用测序进行检测的562个样本也被清晰地分辨。样本包括B.pertussis四中假定的基因型中的三种，并且其中有四种样本被分辨为B.parapertussis。图2显示了典型的结果。
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图1：
A显示了B.pertussis和B.parapertussis的toxin基因的一个短序列信息。 B显示了测序引物的位置。箭头表示测序引物延伸的方向。（R=A+G, Y=C+T） |
| 图2：对四个不同样本按照直接安序列进行dNTPs加样的方法进行序列分析。多态性位点以黄色显示。 |
在进行序列分析的过程中，每种加入的核苷是否可以和模板相结合可以被监控（通过合成的方式进行测序）。在这项研究中，尝试了两中不同的加核苷的顺序。方法一，直接按已知的序列信息进行加样，方法二，按照重复的CGAT的顺序进行加样。通过这两种不同的方式对B.pertussis的toxin gene S1-A进行分析的结果如图3所示。使用按已知顺序进行加样的好处是需要加入的核苷量更少，而且分析速度更快。当按照CGAT重复的序列进行加样时，需要24次加样才可以覆盖这四个多态性位点，然而使用按已知序列进行加样的话，只需14次加样就可以完成。两种方法都可以得到可靠的分型结果，使用按已知序列进行加样的方法可以在SQA软件中得到相对更长的’Good Quality’的DNA序列信息。
参考文献：
1. Parton, R. Review of the biology of Bordetella pertussis. Biologicals 27:71-76 (1999).
2. Mooi, F.R., Hallander, H., Wirsing von König, C.H., Hoet, B., and Guiso, N. Epidemiological typing of Bordetella pertussis isolates: Recommendations for a standard methodology. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 19:174-181 (2002).
3. Ronaghi, M. Improved Performance of Pyrosequencing Using Single-Stranded DNA-binding protein. Anal Biochem 286:282-288 (2000).
三、幽门螺旋杆菌检测
幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori）是引起胃炎，胃溃疡等疾病的主要细菌，并且它与胃癌的形成相关。因此，鉴定胃活体组织中的有机成份具有十分主要的临床意义。对核糖体DNA进行序列分析是一个鉴定细菌的有效方法，尤其是对那些对生长环境要求苛刻、难以培养的有机体。若要治愈胃炎，根除H.pylori，最常用的方法是使用两种抗生素，并结合质子泵抑制剂对病人进行治疗。
抗生素clarithromycin是一种常用于治疗的抗生素，一般有5-10%的H.pylori对其具有抗药性。根据以往的报道，在23S rRNA基因上的两个A到G的突变会影响其抗药性，因此在对病人进行治疗前，要检测这个细菌的显型。
位于-511,-31和+3954的Interleukin-1-beta (Il-1ß) 的多态性被认为是增强Il-1ß的表达，并提高了由H.pylori而引起胃癌的危险。
如果将常规的测序方法用于细菌分型会非常地耗费时间，可能会需要几天或是几周的时间，而且不易于操作。Pyrosequencing™技术可以进行准确并且易于使用的序列分析技术，而且在几小时内就可以得到最终的结果。
研究目标
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研究的目的之一是探讨使用Pyrosequencing™技术分析基因编码的16S rRNA，从而鉴定H.pylori并与其他物种相区分。H.pylori在此基因范围内有一个17bp固定碱基序列，这个序列在与其相关的很多物种中并没有被发现。
其次，分析细菌对clarithromycin的抗药性情况。
最后，分析胃组织中的IL-1B 的SNP。
方法：
PCR扩增：
细菌在液相中生长，使用Amplicor Respiratory Specimen preparation kit (Roche Diagnostic System, Branchburg, NJ, USA) 抽提DNA。设计特异性的PCR引物，分别扩增16S和23S rRNA的133bp和184bp的片段。PCR扩增胃组织中覆盖IL-1B+3954的152bp的基因组DNA，进行SNP分析。对于IL-1B-511和IL-1B-31使用了以touchdowm PCR为起始的semi-nested方法。每对PCR引物之一均以生物素标记。
试样预处理：
根据标准的实验方案，使用PSQ™ 96 Sample Preparation Kit (Pyrosequencing AB) ，将标记有生物素的PCR产物与链亲和素包被的beads（Streptavidin Sepharose™ HP, Amersham Pharmacia Biotech AB, Sweden）相孵育。Gel slurry (4ul) 使用Binding buffer稀释，并与PCR产物在室温下不断摇动混匀10分钟。将beads转移到一块filter plate上，并通过真空过滤（MultiScreen™ Resist Vacuum Manifold, Millipore Inc.）出去液体。DNA在变性液中变性1分钟。使用washing buffer洗涤连有beads的模板，然后转移到一块PSQ 96 SQA Plate上，并且加入40ul annealing buffer与16pmols测序引物在60℃下退火5分钟，然后冷却到室温。
Pyrosequencing™
：使用PSQ 96系统、SQA Reagent Kits (Pyrosequencing AB) 和SQA软件对样本进行序列分析；使用SNP软件和SNP试剂盒进行SNP分析。
结果：
鉴定：
图1显示了对来自于H.pylori的16S rRNA基因分析的典型的结果图。这个样本可以通过这个物种所特有的一段序列（GCGCAATCAGCGTCAGT）而被确定。在这项研究中，使用SQA软件对131个个体的18个碱基序列进行分析。两个样本由于PCR的失败而失败。在余下的129个个体中（相当于测定总长为2322bp的序列），126个样本得到了正确的结果，3个由于读错１个碱基而造成错误。总体准确度在99.87％。
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H.pylori的保守序列使得将其与其他一系列细菌分辨开来成为了可能（表1）。包含有H.pylori的个体并正确鉴定，且结果经过了生物化学方法分型的检验。 |
分类：
同时通过对H.pylori的23S rRNA基因的序列分析，检测其对clarithromycin的抗药性。三种可能的结果如图2所示。分析覆盖突变位点（A2142G和A2143G）的5bp或更长的碱基，154个个体的基因型被正确区分。结果通过最小clarithromycin抗生素浓度的E-test检测而确认。
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患者的基因型：
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结论：
PSQ 96系统、SQA试剂和软件为在临床上具有重要意义的细菌的鉴定和分类提供了易于使用的工具。此外，使用同样的PSQ 96系统，还可以对在H.pylori上的被认为与胃癌的形成相关的interleukin-1-beta的三个多态性位点进行基因型分析。可以使用同一个样本得到以上需要的所有这些信息。使用通过Pyrosequencing™技术得到的信息，可以在数小时的时间内得到一个最佳的治疗方案。
参考文献：
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