免疫细胞化学在神经科学中的应用（2）

1、研究神经递质的超微结构定位

应用免疫电子显微镜技术（常用为PAP法或胶体金标记技术）可显示抗原在神经细胞内的超微结构定位及在突触水平神经元间的联系的化学本质。Pickel应用免疫电镜观察证明TH存在于DA和DA能神经元的细胞体、树突和近侧轴突。

在胞体内此酶定位于内质网、Golgi器和微管上。神经终末枝的突触小泡一般认为是神经递质的亚细胞贮存部位，在电镜下观察神经末梢内突触小泡呈现不同形态。

目前已有文献报道的近10余种，比较常见的为无颗粒小泡型（Small agranular vesicles，SAV）或称清亮小泡型（Small Clear Vesicles，SCV），其直径50～90 nm，中心无颗粒；该型常混有不同比例含致密核心的大囊泡，直径80～150 nm。

其次是颗粒小囊泡型（Small granular vesicles, SGV），直径45～70 nm，内含有电子密度高的致密核心。第三是大颗粒泡型（large granular vesicles，LGV），直径80～160 nm的突触小泡内含有电子密度高的致密核心。其它还有扁平囊泡型、线粒体型等。

是否不同形态的突触小泡代表了含有不同种类的神经递质尚有争论。有学者认为不同形态的突触小泡只是使用不同种类固定液的人工假象，然而越来越多的实验证明表明，固定液的种类固然有一定影响，但神经终末突触小泡的形态和内含递质的种类似乎存在一定的相关性。

SAV型是取得比较一致意见的神经终末类型，它和骨骼肌运动终板（也是神经—肌肉的突触）内所含突触小泡的形态相一致，后者已证明为乙酰胆碱神经递质的贮存处，细胞化学示Ach阳性反应，电刺激时突触小泡减少，示释放现象。这种类型的突触小泡内可能含有乙酰胆碱。

SGV型一般认为是单胺介质的贮存部位，单胺类介质。包括儿茶酚胺和吲胺二种，属于前者的介质有去甲肾上腺素、多巴胺、肾上腺素、属于后者的介质为5-HT。

在常规电镜生物样品处理的过程中，小颗粒囊泡不易显示，须应用0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）配制的3%高锰酸钾溶液（Richardson1966）或铬酸盐/重铬酸盐溶液（Tranzer 1976）固定，方能获得满意结果。

认为SGV是单胺递质贮存部位的根据是：用利血平注射能使小泡内致密核心消失，而用伪介质（Pseudo-neurotransmitter）如5-羟多巴胺（5-OHDA）注射动物，由于伪介质能置换内源性单胺而被吸收和贮存于突触囊泡中，末梢中小颗粒囊泡的数目增加，电刺激交感神经可使小颗粒囊泡减少，而将α甲基去甲肾上腺素给予被拟交感神经药物或被电刺激耗竭了介质的动物，其神经末梢中的小颗粒囊泡又可重新出现。

但1982年Wilson等应用多种实验证明，至少在小肠肌间神经丛内，肾上腺素能神经的终末支是扁平无颗粒囊泡型（flat agranular vesicles, FAV），而不是SGV型。

1965年Taxi在两栖类动物的肠道中发现含大颗粒囊泡的神经终末支LGV，Baumgarten（1970）在哺乳动物肠道也发现了LGV型神经终末支，因其形态与丘脑下部含肽的神经末支相似，故命名为P型神经终末支，意即肽能神经（Peptidergic nerves）终末支，而有作者认为凡是颗粒囊泡，包括SGV和LGV都是单胺类递质的贮存部位。免疫电镜技术部分地解决了这一争论。

应用PAP和胶体金免疫电镜技术证明VIP、SP、降钙基团相关肽（CGRP）和神经肽Y（NPY）等多肽类物质确实定位于大颗粒囊泡中（Larsson 1976, Bishop 1982, Probert et al. 1983）。

有作者还认为不同种类的多肽分别被包含于不同直径的大颗粒囊泡中，如SP定位于直径85 nm的大颗粒囊泡中；VIP：囊泡直径98 nm；ENK：囊泡直径110 nm等，但不同作者在不同动物种属和不同组织、应用方法不同报告结果各异，难以结论。

Fried（1985）应用免疫组化、电镜技术和密度梯度离心法相结合，证明在大鼠输精管神经终末支小颗粒囊泡中含有NA，而大颗粒囊泡分为三种类型：单纯含NPY或NA，或NA与NPY共存于一个囊泡中。

Burnstock还提出直径100～200 nm的大的不透明囊泡（LOV型）系嘌呤能神经递质的贮存部位，神经终末支内全为线粒体所充满的可能属感觉神经终末支。凡此种种，都说明虽然免疫电镜提供了神经递质超微结构水平定位定性的可能，但神经终末内突触小泡的形态与神经递质种类之间的关系始终还有待于进一步的研究。

如SAV型在外周可能是代表胆碱能神经的终末支，在中枢能否说SAV内所含的都是乙酰胆碱，其它各型的突触小泡内所含神经递质的种类也还需要进一步研究。

在技术方法上的运用，根据笔者体会，应用免疫电镜PAP法，免疫反应复合物相当大，有时很难准确地判断免疫反应复合物的定位，因在囊泡基质内和囊泡膜上雹有反应物附着，免疫胶体金电镜技术避免了上述缺点，胶体金颗粒的沉积比较集中于囊泡基质内，在递质超微结构定位的研究上似较PAP法优越。

2、神经递质共存的研究

免疫细胞化学在神经科学的运用打破了传统的一个神经细胞只产生和释放一种神经递质的概念。在中枢和周围神经系统，近年来，有较多的实验报告证明在一个神经细胞内存在两种或两种以上的递质，这种递质共存不是偶然和个别的现象，而是一种带普遍规律的问题。

在光镜水平显示神经细胞内两种抗原的共存，其分辨率只限于胞体，观察神经纤维内两种抗原的共存，必须借助免疫电镜技术。共存情况可出现于：

（1）经典神经递质间，如在大鼠颈上交感神经节的相邻照片上，同一神经细胞分别显示NA和ACh阳性；

（2）经典递质与单胺类递质间，如在松果体交感神经末梢中，不仅含有NA，而且含有5-HT；

（3）经典递质和神经肽间，如在大鼠的椎前神经节中，大约有60%的NA能神经细胞同时显示SOM免疫反应阳性，说明SOM与NA的共存，在交感神经系统中NPY与NA的共存，在副交感神经系统中VIP与ACh的共存，已得到较为普遍的证实；

（4）单胺类递质与神经肽的共存，如大鼠输精管的交感神经终末支中NA与NPY的共存，在豚鼠肠道肌间神经节中5-HT与SP免疫反应物共存一个神经细胞内；

（5）神经肽间的共存，如SP与CGRP常共存于感觉神经终末支，Gibbins等（1987）在豚鼠背根神经节　细胞中证明SP、CGRP、CCK和强啡肽（Dynorphin，DYN）四种神经肽的共存。

对于神经递质共存的亚细胞部位，Hokfelt曾对肽和胺的共存提出了一种假说，即：

①它们可分别贮存于同一神经终末内的不同形态的突触小泡内；

②共存于大颗粒囊泡和小颗粒囊泡内；

③仅共存于小颗粒囊泡中；

④仅共存于大颗粒囊泡内；此假说尚待进一步证实。

Fried的实验结果表明，在大鼠输精管，胺和肽的共存仅发生于大颗粒囊泡内，Andrzejloesch和Burnstock实验证明在豚鼠肠道肌间神经丛内VIP和ACh共存于SAV小囊泡内。应用胶体金免疫电镜技术，以不同直径的金粒标记不同的抗原，是研究递质共存的超微结构定位较为理想的手段。

关于递质共存的生理意义，目前还不十分清楚，有作者设想与经典递质共存的肽类可作为辅递质，在神经细胞释放时，对突触后膜上主递质的受体起调制作用，从而调制信息传递。

Hokfelt（1980）提出两种递质共存的生理意义有以下五种可能性：

①两种递质可穿过突触间隙作用于突触后细胞，作用于相同或不同的受体；

②一种物质激活突触后细胞的受体，另一种物质则封闭另一种类型的受体，如在5-HT和SP共存的情况下，5-HT直接抑制突触后细胞，SP封闭其它末梢释放的ACh对突触后的细胞的兴奋作用；

③一种物质作用于突触后细胞，第二种物质则作用于突触前末梢的自身受体（autoreceptor），从而调制细胞终末对神经递质的释放；

④一种物质作用于突触后细胞，第二种物质则作用于其它末梢上的突触前受体；

⑤一种物质作用于一类细胞，另一种物质作用于另一种细胞，在这方面典型的例子是汗腺，汗腺的交感神经元内含有VIP和ACh，前者作用于周围小血管，增加血流量；后者作用于腺体，刺激汗腺分泌。

总之，递质共存的研究是神经科学领域中一个崭新的课题，它的研究对进一步了解复杂的神经系统的结构和功能有重要意义，而在这项课题的研究中，免疫细胞化学（包括光镜和电镜）无疑是一项有力的工具。