克隆心得—帮助新手快速做出克隆

本方法的核心部分是医科院基础所的生化脂蛋白组的吴刚老师所创，我在其基础上进行了一些改动，主要是DNA回收上采取了更简单的方法。（本方法最适用于双酶切制作片断并进行克隆 的情况。对于分步酶切制作片断，也可以使用本方法，但需要加倍起始酶切DNA的量。）

一、片断平移的克隆 （也适用于多片断连接）

简介：将用作载体的质粒A（制作大片断）酶切3μL ，要切出小片断的质粒B酶切7μL；琼脂糖回收胶电泳；切胶回收来自质粒A的大片段，和来自B的小片断，并回收到一管中；酚氯仿法回收DNA，酒精沉淀，干燥；加入8μL水、1μLligase Buffer、1μL ligase ，4℃过夜；次日转化涂板。

酶切

配置可酶切共10μL质粒的酶切反应体系（双酶切）：

（提示 在克隆 设计时尽量使用好切的内切酶，且注意这两个酶有比较兼容的Buffer，即在这种公用Buffer中，两酶的效力变化不大。酶切体系根据需要，可加入BSA。）

酶切体系

A质粒酶切－制作载体片断

公用Buffer 3μL

酶 I 1μL

酶 II 1μL

质粒 3μL

双蒸水 22μL

合计 30μL

B质粒酶切－制作插入片断

公用Buffer 7μL

酶 I 2μL

酶 II 2μL

质粒 7μL

双蒸水 52μL

合计 70μL

混匀

37℃，酶切3小时。

（提示 关于酶量的问题。通常的内切酶效价在10U/μL左右，3μL内切酶相当于30U，足够切10μL的质粒。因为通常小提质粒的浓度在200－600ng/μL，一般浓度达不到1μg/μL。根据1U酶切1μg质粒的原则，这一酶量是足够的。）

1%琼脂糖回收胶回收（碎胶、酚氯仿抽提法）

1. 酶切产物加入10％量的上样Buffer，混匀。使用1%的琼脂糖回收胶，电泳回收酶切产物。

2. 用手术刀切下所需要的大片断（载体）和小片断（插入片断），收入一个1.5mL离心管中。（提示: 切胶前，需用分别含酒精、NaOH和双蒸水的纸巾擦拭凝胶接触的台面，以防污染。 手术刀要火焰消毒，而后切胶回收。）

3. 12000rpm 1分钟，将凝胶甩到管底。 -20℃ 冰冻20分钟。

4. 取200μL Tip 头两只，在酒精灯上稍烤化Tip头尖端，两Tip头尖相对来回相接触，在Tip头顶部制成直径3mm左右的平头，准备用于碎胶。

5. 从-20℃取出冻结的凝胶，立即使用200μL枪套上平头Tip头，捣碎凝胶。（提示 200μL的枪足够粗壮，不要用100μL的枪，小心折断！！！ 乘凝胶比较硬时就开始碎胶，轻而频率高地捣碎凝胶）

6. 凝胶管中加入500μL双蒸水，盖紧，振摇200下。

7. 加入500μL Tris饱和纯酚，盖紧，振摇200下。 12000rpm 4℃ 离心15分钟。

8. 在一新1.5mL 离心管中加入 500μL 氯仿：异戊醇（24：1），将步骤7的上清加入本步骤离心管中。盖紧，振摇200下。 12000rpm 4℃ 离心5分钟。

9. 在一新1.5mL 离心管中加入 900μL 预冷 无水乙醇、20μL 3M的醋酸钠。将步骤8的上清小心加入本步骤离心管中。颠倒数次混匀。12000rpm 4℃ 离心15分钟。（提示 吸取步骤8中的上清时，千万不要将有机相吸入，宁可放弃一些上清，否则影响后面的连接反应。 另外，本方法使用的醋酸钠量较小，但足够沉淀核酸，并且无需洗盐。）

10. 弃上清，将离心管倒置于干净吸水纸巾上5分钟。室温下吹风干燥。（提示 可将试管至于超净台吹风干燥。如果管底有较多液体聚集，可盖好管盖后，轻弹管底数次，将液体分散挂在管壁上，再打开管盖吹风。）

连接

向回收DNA的试管中加入8μL 双蒸水，盖紧，弹击管底使液体尽量接触管壁。瞬时离心将液体甩到管底，再加入1μL ligase Buffer，1μL T4 ligase（连接酶）。弹击管壁混匀，瞬时离心将液体甩到管底。 置4℃过夜。 （提示 Ligase Buffer应该在首次融解后分装，每管可2-3μL，-20℃存储。 4℃过夜可获得最多的转化克隆 。）

二、PCR产物接入质粒的克隆

简介： 取100μL PCR产物，酒精沉淀、干燥，直接加入酶切体系酶切；将用作载体的质粒A（制作大片断）酶切3μL；切胶回收来自质粒A的大片段，和来自PCR产物的小片断，并回收到一管中；酚氯仿法回收DNA，酒精沉淀，干燥；加入8μL水、1μLligase Buffer、1μL ligase ，4℃过夜；次日转化涂板。

PCR产物回收

1. 制备100μL PCR产物。

2. 将100μL PCR产物加入一1.5mL离心管中，再加入400μL双蒸水，颠倒混匀。加入 900μL 预冷 无水乙醇、20μL 3M的醋酸钠。颠倒数次混匀。（提示 本方法使用的醋酸钠量较小，但足够沉淀核酸，并且无需洗盐。）

3. 4℃静置30分钟，以利于核酸沉淀。

4. 12000rpm 4℃ 离心15分钟，沉淀核酸。

5. 弃上清，将离心管倒置于干净吸水纸巾上5分钟。室温下吹风干燥。（提示 可将试管至于超净台吹风干燥。如果管底有较多液体聚集，可盖好管盖后，轻弹管底数次，将液体分散挂在管壁上，再打开管盖吹风。）

酶切

直接在回收PCR产物的试管中配置酶切体系：

PCR产物酶切－制作插入片断

公用Buffer 6μL

酶 I   3μL

酶 II   3μL

PCR产物   ——

双蒸水   48μL

合计   60μL

要将PCR产物接入的质粒载体A，取A质粒3μL进行酶切。

A质粒酶切－制作载体片断

公用Buffer 3μL

酶 I   1μL

酶 II   1μL

质粒   3μL

双蒸水   22μL

合计   30μL

混匀

37℃，酶切3小时。

1%琼脂糖回收胶回收（碎胶、酚氯仿抽提法）

1. 酶切产物加入10％量的上样Buffer，混匀。使用1%的琼脂糖回收胶，电泳回收酶切产物。

2. 用手术刀切下所需要的大片断（载体）和小片断（插入片断），收入一个1.5mL离心管中。 （提示 切胶前，需用分别含酒精、NaOH和双蒸水的纸巾擦拭凝胶接触的台面，以防污染。 手术刀要火焰消毒，而后切胶回收。）

3. 12000rpm 1分钟，将凝胶甩到管底。 -20℃ 冰冻20分钟。

4. 取200μL Tip 头两只，在酒精灯上稍烤化Tip头尖端，两Tip头尖相对来回相接触，在Tip头顶部制成直径3mm左右的平头，准备用于碎胶。

5. 从-20℃取出冻结的凝胶，立即使用200μL枪套上平头Tip头，捣碎凝胶。（提示 200μL的枪足够粗壮，不要用100μL的枪，小心折断！！！ 乘凝胶比较硬时就开始碎胶，轻而频率高地捣碎凝胶）

6. 凝胶管中加入500μL双蒸水，盖紧，振摇200下。

7. 加入500μL Tris饱和纯酚，盖紧，振摇200下。 12000rpm 4℃ 离心15分钟。

8. 在一新1.5mL 离心管中加入 500μL 氯仿：异戊醇（24：1），将步骤7的上清加入本步骤离心管中。盖紧，振摇200下。 12000rpm 4℃ 离心5分钟。

9. 在一新1.5mL 离心管中加入 900μL 预冷 无水乙醇、20μL 3M的醋酸钠。将步骤8的上清小心加入本步骤离心管中。颠倒数次混匀。12000rpm 4℃ 离心15分钟。（提示 吸取步骤8中的上清时，千万不要将有机相吸入，宁可放弃一些上清，否则影响后面的连接反应。 另外，本方法使用的醋酸钠量较小，但足够沉淀核酸，并且无需洗盐。）

10. 弃上清，将离心管导致于干净吸水纸巾上5分钟。室温下吹风干燥。（提示 可将试管至于超净台吹风干燥。 如果管底有较多液体聚集，可盖好管盖后，轻弹管底数次，将液体分散挂在管壁上，再打开管盖吹风）

连接

向回收DNA的试管中加入8μL 双蒸水，盖紧，弹击管底使液体尽量接触管壁。瞬时离心将液体甩到管底，再加入1μL ligase Buffer，1μL T4 ligase（连接酶）。弹击管壁混匀，瞬时离心将液体甩到管底。 置4℃过夜。 （提示 Ligase Buffer应该在首次融解后分装，每管可2-3μL，-20℃存储。 4℃过夜可获得最多的转化克隆 。）

三、 一步法感受态细胞制作 （已经检验过DH5α和BL21系菌，采用此方法的转化效率足够高）

来自Nucleic Acid Research 1988 16 3580

Rapid and Convenient method for the preparation and storage of competent bacterial cells.

Chung CT, Miller RH.

下载链接：http://www.pubmedcentral.gov/pagerender.fcgi?artid=336520&pageindex=1

（提示：建议首次使用本方法时，先培养20mL菌，可得到总数2mL的感受态菌，足够作30次转化。制作感受态细胞时注意无菌操作。）

1. LB medium 培养至 OD值 0.3-0.5。

2. 4℃ 3000g（或6000rpm） 5分钟。弃上清，收菌。

3. 重悬于原培养体积1/10的TSB中。

4. 冰上置10分钟。 分装，每管60μL，置冰上。放入－70℃冰箱。（提示 每次使用拿出一管，避免反复冻融。 －70℃可保存一年不影响转化效率）

TSB配方（需高压）：

LB （PH6.1）

10%  PEG 3350

5%  DMSO

10mM  MgCI2

10mM  MgSO4

10％  甘油

5×KCM溶液配方：（配置数毫升即可，－20 ℃保存，可反复冻融）

0.5 M  KCI

0.15M   CaCl2

0.25M  MgCI2

转化Protocol：

1. 连接产物10μL、5×KCM溶液10μL、双蒸水30μL，（共50μL）混匀，置冰上。

2. 从-70℃冰箱中取 1支感受态细胞，置冰上。融化后立即取50μL，加入步骤1中的混合液中，轻轻吹打数次混匀（不可用力过大，不可涡旋）， 立即置冰上。

3. 冰上放置20 分钟。

4. 室温放置10分钟。

5. 加入500μL新鲜LB， 150转37 ℃ 1小时。

6. 6000转/分 5分钟离心收菌。留150μL上清（其余上清丢弃），吹打数次，重悬菌体。

7. 涂板。 37 ℃ 孵箱过夜。

（提示：可使用质粒转化该感受态细菌，检验转化效率。1μL的质粒转化，DH5α菌板满板不可计数；BL21菌板有200－300个菌落。）

小结：

本方法采用简洁的步骤。最有特点的地方是片断回收后收到一个试管中，而不象一般的操作分别收到不同的试管中，回收后再电泳定量，并计算大小片断的比例，最后配置连接体系。

这种简洁的步骤不仅提高效率、避免引入人为的误差（例如肉眼对DNA的定量的误差），还减少了DNA的损失，保证了更多的DNA（实际上是全部的DNA）进入下面的连接反应。

所以本方法的第一个优点，是保证连接和转化中，有“足够量”的核酸。 连接和转化的核酸量得到保证，克隆 成功就得到保证。

例如本方法中，制作大片断的A质粒取3μL，对于通常的小提质粒，3μL意味者600－1800ng的DNA。一般认为大片段的适当范围是50－200ng/10μL连接反应。本方法即使在回收过程中损失一半，仍然剩300－900ng。实际上，使用本方法，在片断平移的克隆 中，如果把转化的菌液全部涂板，得到的克隆 多得不可计数；片断平移克隆 实际上只取一半转化菌涂板即可。 PCR接入载体的克隆 效率没有那么高，但是一般也达到40－60转化子/平板。

本方法的另一优点，是这些看起来固定的步骤，例如酶切、酶连、以及转化等方案，实际上已经遵循了很多原则，而且这些步骤之间互相平衡，组成一个很稳定和可操作性很强的系统。

例如起始酶切A质粒和B质粒的量——3μL：7μL，已经隐含了载体：插入片断＝1：2~3的比例（PCR克隆 经折算后大概是1：5~10）。即使加上DNA回收中会损失、大片断和小片断回收效率不同、酶切质粒同酶切PCR效率不同等影响因素，最后回收在试管中的大小片断比例仍然可以落在一个合适的范围内。

酶切使用的酶量，是经过计算的。可以保证是采用3－5倍的量切割质粒或PCR片断，因此可以保证酶切反应的效率。

连接反应在4℃下可以达到最大的转化率。实际上对于大多数粘端突出3碱基的酶切位点，18 ℃ 3小时已经足够。

Nucleic Acid Research上登载的感受态菌制备方法，可以得到效果很稳定的感受态细胞。每微克DNA可获得10的八次方个转化子。

因此，这套方法考虑到了克隆 的每个重要环节，并以可靠的手段将这些环节“固定”下来。这套方法对于操作者和试剂带来的波动也有很好的“容错”能力，或者说，它的系统冗余比较大，保证了这套方法极高的成功率。