克隆心得―帮助新手快速做出克隆
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一步法感受态细胞制作
（已经检验过DH5α和BL21系菌，采用此方法的转化效率足够高）
来自Nucleic Acid Research 1988 16 3580
Rapid and Convenient method for the preparation and storage of competent bacterial cells.
Chung CT, Miller RH.
1. LB medium 培养至 OD值 0.3-0.5。
2. 4℃ 3000g（或6000rpm） 5分钟。弃上清，收菌。
3. 重悬于原培养体积1/10的TSB中。
4. 冰上置10分钟。 分装，每管60μL，置冰上。放入－70℃冰箱。（提示 每次使用拿出一管，避免反复冻融。 －70℃可保存一年不影响转化效率）
TSB配方（需高压）：
LB （PH6.1）
10% PEG 3350
5% DMSO
10mM MgCI2
10mM MgSO4
10％ 甘油
5×KCM溶液配方：（配置数毫升即可，－20 ℃保存，可反复冻融）
0.5 M KCI
0.15M CaCl2
0.25M MgCI2
转化Protocol：
1. 连接产物10μL、5×KCM溶液10μL、双蒸水30μL，（共50μL）混匀，置冰上。
2. 从-70℃冰箱中取 1支感受态细胞，置冰上。融化后立即取50μL，加入步骤1中的混合液中，轻轻吹打数次混匀（不可用力过大，不可涡旋）， 立即置冰上。
3. 冰上放置20 分钟。
4. 室温放置10分钟。
5. 加入500μL新鲜LB， 150转37 ℃ 1小时。
6. 6000转/分 5分钟离心收菌。留150μL上清（其余上清丢弃），吹打数次，重悬菌体。
7. 涂板。 37 ℃ 孵箱过夜。
（提示：可使用质粒转化该感受态细菌，检验转化效率。1μL的质粒转化，DH5α菌板满板不可计数；BL21菌板有200－300个菌落。）
小结：
本方法采用简洁的步骤。最有特点的地方是片断回收后收到一个试管中，而不象一般的操作分别收到不同的试管中，回收后再电泳定量，并计算大小片断的比例，最后配置连接体系。
这种简洁的步骤不仅提高效率、避免引入人为的误差（例如肉眼对DNA的定量的误差），还减少了DNA的损失，保证了更多的DNA（实际上是全部的DNA）进入下面的连接反应。
所以本方法的第一个优点，是保证连接和转化中，有“足够量”的核酸。 连接和转化的核酸量得到保证，克隆 成功就得到保证。
例 如本方法中，制作大片断的A质粒取3μL，对于通常的小提质粒，3μL意味者600－1800ng的DNA。一般认为大片段的适当范围是 50－200ng/10μL连接反应。本方法即使在回收过程中损失一半，仍然剩300－900ng。
实际上，使用本方法，在片断平移的克隆 中，如果把转化的菌液全部涂板，得到的克隆 多得不可计数；片断平移克隆 实际上只取一半转化菌涂板即可。 PCR接入载体的克隆 效率没有那么高，但是一般也达到40－60转化子/平板。
本方法的另一优点，是这些看起来固定的步骤，例如酶切、酶连、以及转化等方案，实际上已经遵循了很多原则，而且这些步骤之间互相平衡，组成一个很稳定和可操作性很强的系统。
例 如起始酶切A质粒和B质粒的量——3μL：7μL，已经隐含了载体：插入片断＝1：2~3的比例（PCR克隆 经折算后大概是1：5~10）。即使加上DNA回收中会损失、大片断和小片断回收效率不同、酶切质粒同酶切PCR效率不同等影响因素，最后回收在试管中的 大小片断比例仍然可以落在一个合适的范围内。
酶切使用的酶量，是经过计算的。可以保证是采用3－5倍的量切割质粒或PCR片断，因此可以保证酶切反应的效率。
连接反应在4℃下可以达到最大的转化率。实际上对于大多数粘端突出3碱基的酶切位点，18 ℃ 3小时已经足够。
Nucleic Acid Research上登载的感受态菌制备方法，可以得到效果很稳定的感受态细胞。每微克DNA可获得10的八次方个转化子。
因此，这套方法考虑到了克隆 的每个重要环节，并以可靠的手段将这些环节“固定”下来。这套方法对于操作者和试剂带来的波动也有很好的“容错”能力，或者说，它的系统冗余比较大，保证了这套方法极高的成功率。
三、 一步法感受态细胞制作
（已经检验过DH5α和BL21系菌，采用此方法的转化效率足够高）
来自Nucleic Acid Research 1988 16 3580
Rapid and Convenient method for the preparation and storage of competent bacterial cells.
Chung CT, Miller RH.
下载链接：http://www.pubmedcentral.gov/pagerender.fcgi?artid=336520&pageindex=1
（提示：建议首次使用本方法时，先培养20mL菌，可得到总数2mL的感受态菌，足够作30次转化。制作感受态细胞时注意无菌操作。）
1. LB medium 培养至 OD值 0.3-0.5。
2. 4℃ 3000g（或6000rpm） 5分钟。弃上清，收菌。
3. 重悬于原培养体积1/10的TSB中。
4. 冰上置10分钟。 分装，每管60μL，置冰上。放入－70℃冰箱。（提示 每次使用拿出一管，避免反复冻融。 －70℃可保存一年不影响转化效率）
TSB配方（需高压）：
LB （PH6.1）
10% PEG 3350
5% DMSO
10mM MgCI2
10mM MgSO4
10％ 甘油
5×KCM溶液配方：（配置数毫升即可，－20 ℃保存，可反复冻融）
0.5 M KCI
0.15M CaCl2
0.25M MgCI2
转化Protocol：
1. 连接产物10μL、5×KCM溶液10μL、双蒸水30μL，（共50μL）混匀，置冰上。
2. 从-70℃冰箱中取 1支感受态细胞，置冰上。融化后立即取50μL，加入步骤1中的混合液中，轻轻吹打数次混匀（不可用力过大，不可涡旋）， 立即置冰上。
3. 冰上放置20 分钟。
4. 室温放置10分钟。
5. 加入500μL新鲜LB， 150转37 ℃ 1小时。
6. 6000转/分 5分钟离心收菌。留150μL上清（其余上清丢弃），吹打数次，重悬菌体。
7. 涂板。 37 ℃ 孵箱过夜。
（提示：可使用质粒转化该感受态细菌，检验转化效率。1μL的质粒转化，DH5α菌板满板不可计数；BL21菌板有200－300个菌落。）
小结：
本方法采用简洁的步骤。最有特点的地方是片断回收后收到一个试管中，而不象一般的操作分别收到不同的试管中，回收后再电泳定量，并计算大小片断的比例，最后配置连接体系。
这种简洁的步骤不仅提高效率、避免引入人为的误差（例如肉眼对DNA的定量的误差），还减少了DNA的损失，保证了更多的DNA（实际上是全部的DNA）进入下面的连接反应。
所以本方法的第一个优点，是保证连接和转化中，有“足够量”的核酸。 连接和转化的核酸量得到保证，克隆 成功就得到保证。
例 如本方法中，制作大片断的A质粒取3μL，对于通常的小提质粒，3μL意味者600－1800ng的DNA。一般认为大片段的适当范围是 50－200ng/10μL连接反应。本方法即使在回收过程中损失一半，仍然剩300－900ng。实际上，使用本方法，在片断平移的克隆 中，如果把转化的菌液全部涂板，得到的克隆 多得不可计数；片断平移克隆 实际上只取一半转化菌涂板即可。 PCR接入载体的克隆 效率没有那么高，但是一般也达到40－60转化子/平板。
本方法的另一优点，是这些看起来固定的步骤，例如酶切、酶连、以及转化等方案，实际上已经遵循了很多原则，而且这些步骤之间互相平衡，组成一个很稳定和可操作性很强的系统。
例 如起始酶切A质粒和B质粒的量——3μL：7μL，已经隐含了载体：插入片断＝1：2~3的比例（PCR克隆 经折算后大概是1：5~10）。即使加上DNA回收中会损失、大片断和小片断回收效率不同、酶切质粒同酶切PCR效率不同等影响因素，最后回收在试管中的 大小片断比例仍然可以落在一个合适的范围内。
酶切使用的酶量，是经过计算的。可以保证是采用3－5倍的量切割质粒或PCR片断，因此可以保证酶切反应的效率。
连接反应在4℃下可以达到最大的转化率。实际上对于大多数粘端突出3碱基的酶切位点，18 ℃ 3小时已经足够。
Nucleic Acid Research上登载的感受态菌制备方法，可以得到效果很稳定的感受态细胞。每微克DNA可获得10的八次方个转化子。
因此，这套方法考虑到了克隆 的每个重要环节，并以可靠的手段将这些环节“固定”下来。这套方法对于操作者和试剂带来的波动也有很好的“容错”能力，或者说，它的系统冗余比较大，保证了这套方法极高的成功率。
三、 一步法感受态细胞制作
（已经检验过DH5α和BL21系菌，采用此方法的转化效率足够高）
来自Nucleic Acid Research 1988 16 3580
Rapid and Convenient method for the preparation and storage of competent bacterial cells.
Chung CT, Miller RH.
下载链接：http://www.pubmedcentral.gov/pagerender.fcgi?artid=336520&pageindex=1
（提示：建议首次使用本方法时，先培养20mL菌，可得到总数2mL的感受态菌，足够作30次转化。制作感受态细胞时注意无菌操作。）
1. LB medium 培养至 OD值 0.3-0.5。
2. 4℃ 3000g（或6000rpm） 5分钟。弃上清，收菌。
3. 重悬于原培养体积1/10的TSB中。
4. 冰上置10分钟。 分装，每管60μL，置冰上。放入－70℃冰箱。（提示 每次使用拿出一管，避免反复冻融。 －70℃可保存一年不影响转化效率）
TSB配方（需高压）：
LB （PH6.1）
10% PEG 3350
5% DMSO
10mM MgCI2
10mM MgSO4
10％ 甘油
5×KCM溶液配方：（配置数毫升即可，－20 ℃保存，可反复冻融）
0.5 M KCI
0.15M CaCl2
0.25M MgCI2
转化Protocol：
1. 连接产物10μL、5×KCM溶液10μL、双蒸水30μL，（共50μL）混匀，置冰上。
2. 从-70℃冰箱中取 1支感受态细胞，置冰上。融化后立即取50μL，加入步骤1中的混合液中，轻轻吹打数次混匀（不可用力过大，不可涡旋）， 立即置冰上。
3. 冰上放置20 分钟。
4. 室温放置10分钟。
5. 加入500μL新鲜LB， 150转37 ℃ 1小时。
6. 6000转/分 5分钟离心收菌。留150μL上清（其余上清丢弃），吹打数次，重悬菌体。
7. 涂板。 37 ℃ 孵箱过夜。
（提示：可使用质粒转化该感受态细菌，检验转化效率。1μL的质粒转化，DH5α菌板满板不可计数；BL21菌板有200－300个菌落。）
小结：
本方法采用简洁的步骤。最有特点的地方是片断回收后收到一个试管中，而不象一般的操作分别收到不同的试管中，回收后再电泳定量，并计算大小片断的比例，最后配置连接体系。
这种简洁的步骤不仅提高效率、避免引入人为的误差（例如肉眼对DNA的定量的误差），还减少了DNA的损失，保证了更多的DNA（实际上是全部的DNA）进入下面的连接反应。
所以本方法的第一个优点，是保证连接和转化中，有“足够量”的核酸。 连接和转化的核酸量得到保证，克隆 成功就得到保证。
例 如本方法中，制作大片断的A质粒取3μL，对于通常的小提质粒，3μL意味者600－1800ng的DNA。一般认为大片段的适当范围是 50－200ng/10μL连接反应。本方法即使在回收过程中损失一半，仍然剩300－900ng。实际上，使用本方法，在片断平移的克隆 中，如果把转化的菌液全部涂板，得到的克隆 多得不可计数；片断平移克隆 实际上只取一半转化菌涂板即可。 PCR接入载体的克隆 效率没有那么高，但是一般也达到40－60转化子/平板。
本方法的另一优点，是这些看起来固定的步骤，例如酶切、酶连、以及转化等方案，实际上已经遵循了很多原则，而且这些步骤之间互相平衡，组成一个很稳定和可操作性很强的系统。
例 如起始酶切A质粒和B质粒的量——3μL：7μL，已经隐含了载体：插入片断＝1：2~3的比例（PCR克隆 经折算后大概是1：5~10）。即使加上DNA回收中会损失、大片断和小片断回收效率不同、酶切质粒同酶切PCR效率不同等影响因素，最后回收在试管中的 大小片断比例仍然可以落在一个合适的范围内。
酶切使用的酶量，是经过计算的。可以保证是采用3－5倍的量切割质粒或PCR片断，因此可以保证酶切反应的效率。
连接反应在4℃下可以达到最大的转化率。实际上对于大多数粘端突出3碱基的酶切位点，18 ℃ 3小时已经足够。
Nucleic Acid Research上登载的感受态菌制备方法，可以得到效果很稳定的感受态细胞。每微克DNA可获得10的八次方个转化子。
因此，这套方法考虑到了克隆 的每个重要环节，并以可靠的手段将这些环节“固定”下来。这套方法对于操作者和试剂带来的波动也有很好的“容错”能力，或者说，它的系统冗余比较大，保证了这套方法极高的成功率。
