细胞凋亡检测及相关分子检测

一、细胞 DNA 含量分布（由细胞 DNA 降解方式检测细胞凋亡）

① 收集已固定的单细胞悬液约 5×105~1×106/ml；

② 离心除去固定液，3ml PBS 重悬细胞;

③ 1500rpm 离心，5 分钟 ，弃去 PBS；

④ 加 PI 染液 1ml，室温避光 20 分钟；

⑤ 调整细胞浓度 5×105/ml；

⑥ 上机检测。

二、磷脂酰丝氨酸外翻分析检测细胞凋亡

1. 常规制备单细胞悬液，用 PBS 洗两次。( 若为全血要先溶血)，取约 5×106 个细胞，1500rpm离心，弃上清，用 400μl 1×Binding Buffer重悬；

2. 分成 a、b、c、d、e 五管，每管约 1×106 个细胞

① 阴性对照，不加任何试剂；

② 阳性对照，加 2%多聚甲醛固定 30 分钟，加 AnnexinV5μl，室温 10min，用 1×Binding Buffer洗一次，弃上清再加 190μ l 缓冲液、10μl PI 避光 15 分钟。

③ 加 10μl PI，避光孵育 15 分钟；

④ 加 5μl AnnexinV 液，室温避光孵育 15min；

⑤ 加 10μl PI 和 5μ l AnnexinV 液，室温避光孵育 5min；

3. 每管各加 400μ l 1×BindingBuffer。

4. 上机检测。

注意：① 操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞；② 操作时注意避光；③ 反应完毕后尽快检测，最好在一小时内检测。

三、用单克隆抗体 APO2.7 检测细胞凋亡

1. 放置 0.5~1×106 个细胞到试管中；

2. 室温离心 200g，6min；

3. 弃上清，加入 100μl 冷的（ 4℃）在 PBSF 溶液中含 100μg/ml 的digitonnin，轻轻地重悬细胞，在冰上孵育 20min；

4. 加入 2ml 冷的（4℃）PBSF 液，室温离心 200g，6min；

5. 弃上清，加入20μl PE 标记的 Apo2.7 单克隆抗体和 80μ l PBSF 液，用 vortex 轻轻震荡，室温避光孵育 15 分钟；

6. 加入 2ml PBSF 液，室温离心 200g，6min；

7. 弃上清，加入 1ml PBSF 液重悬细胞；

8. 避光保存，直到流式细胞仪检测。PBSF：含 2.5% FCS（v/v）和 0.01%NaN3（w/v）的 PBS。