三色书虱体内wolbachia的分子检测

一、实验试剂

二、实验设备

SW-CJ-CO净化工作台、FA1004A型电子天平、70型离子纯水器、SZ-93自动双重纯水蒸馏器、Mikro22R型高速冰冻离心机、

5415D台式离心机、SS-325型高压灭菌器、YLE-2000数显式电热恒温水浴锅、pHS-4C型酸度计、2002型振荡器、

旋涡混合器、梯度热循环仪、凝胶成像系统、MDF-382E型超低温保存箱、DYY 12型电脑三恒多用电泳仪、SmartSpecTM3000核酸浓度分析仪。

三、实验材料

三色书虱采自野外，在实验室内建立种群。

四、实验步骤

1. 三色书虱总DNA的制备

(1) 将50头书虱置于1.5 mL的离心管中，用研棒在液氮环境中迅速将试虫充分研碎后加入200 μL DNA提取裂解液。

(2) 加入2.5 μL蛋白酶K溶液(20 mg/mL)，50℃水浴2 h(或培养过夜)。

(3) 用等体积的平衡酚( Tris-HC1饱和酚，pH7.8 )，温和振荡摇匀(约20 min )，置20℃下保存5-10 min。

(4) 4℃下离心10 min，将粘稠的水相移至洁净的离心管中。

(5) 用等体积的酚:氯仿(1:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿各抽提取一次，离心(9 000 r/min 10 min)取上清液。

(6) 加入0.2倍体积的乙酸钠溶液(10 mol/L)和两倍体积的无水乙醇，-20℃放置2 h使DNA充分沉淀。

(7) 离心(12 000 r/min 10 min )，弃上清液，沉淀用70%乙醇(4℃)洗涤两次。

(8) 沉淀晾干(尽可能除去乙醇)后，将DNA重悬浮于TE缓冲液(pH8.0 )，于37℃中轻轻摇动有利于DNA重悬浮，使DNA充分溶解。

(9) 加入Rnase至终浓度为1 μg/mL，37℃保温1 h。

(10) 按(4)~(9)抽提，沉淀，重悬DNA，在1 μL双蒸灭菌水或TE中，4℃保存。

(11) 取DNA4 μL与2 μL 6x加样缓冲液混匀，点样到1.4%琼脂糖凝胶中，以2.5-5 v/cm电泳。

(12) 0.5 μg/mL的EB染色15-30 min，紫外灯下观察拍照。

制备的DNA浓度用SmartSpecTM3000核酸浓度分析仪检测，要求先将比色杯用100 μL/次的无菌水反复清洗再测水的吸光度，之后将DNA液稀释50倍进行检测。要求OD=1.7左右。

2. 三色书虱体内共生细菌Wolbachia的Long PCR检测

Long PCR的20 uL的反应体系包括:

10 x buffer：5 μL

25 mM MgCl₂：2 μL

10 mM dNTP：0.7 μL

Pwo酶：1 U

Taq DNA：5 U

模板：10 ng

10μM引物：1.6 μL

wsp-F, 5'-TGG TCC AAT AAG TGA TGA AAG AAA CTA GCT A

wsp-R, 5'-AAAAAT TAAACG CTA CTC CAG CTT CTG CAC

用无菌水将反应体系补充至20 μL

扩增条件为：94 ℃ 2 min预变性后，94℃10 sec，65℃ 30 sec，68℃ 1 min，10个循环；94℃ 10 sec，65℃ 30 sec，68℃ 1 min。25个循环，每个循环在68℃下延长20 sec。

扩增结束后取5 μL的PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测(电压5 v/cm，电泳缓冲液为1 X TAE )，Bio-Rad凝胶成象系统下观察结果。

3. 序列的测定和分析

Wolbachia wsp基因序列由Long PCR产物上海生工直接测序获得。DNA序列检索和同源性比较利用BLAST工具(NCBI网站)。用程序中的最大似然法(Maximum Likelihood method，ML)重建系统发生树，系统发生树中结点的自举检验置信度以1 000次重复计算估计。对获得的三色书虱体内Wolbachia的wsp基因的片段进行系统发育分析，其它一些宿主体内的Wolbachia的wsp基因的片段则通过GenBank获得。