克隆心经——一套帮助新手快速作出克隆的Protocol
丁香园
3709
本方法的核心部分是医科院基础所的生化脂蛋白组的吴刚老师所创，我在其基础上进行了一些改动，主要是DNA回收上采取了更简单的方法。
（本方法最适用于双酶切制作片断并进行克隆的情况。对于分步酶切制作片断，也可以使用本方法，但需要加倍起始酶切DNA的量。）
一、片断平移的克隆（也适用于多片断连接）
简介：将用作载体的质粒A（制作大片断）酶切3μL ，要切出小片断的质粒B酶切7μL；琼脂糖回收胶电泳；切胶回收来自质粒A的大片段，和来自B的小片断，并回收到一管中；酚氯仿法回收DNA，酒精沉淀，干燥；加入8μL水、1μLligase Buffer、1μL ligase ，4℃过夜；次日转化涂板。
酶切
1. 配置可酶切共10μL质粒的酶切反应体系（双酶切）：
（提示 在克隆设计时尽量使用好切的内切酶，且注意这两个酶有比较兼容的Buffer，即在这种公用Buffer中，两酶的效力变化不大。酶切体系根据需要，可加入BSA。）
酶切体系
A质粒酶切－制作载体片断
公用Buffer 3μL
酶 I 1μL
酶 II 1μL
质粒 3μL
双蒸水 22μL
合计 30μL
B质粒酶切－制作插入片断
公用Buffer 7μL
酶 I 2μL
酶 II 2μL
质粒 7μL
双蒸水 52μL
合计 70μL
混匀。37℃，酶切3小时。
（提示 关于酶量的问题。通常的内切酶效价在10U/μL左右，3μL内切酶相当于30U，足够切10μL的质粒。因为通常小提质粒的浓度在200－600ng/μL，一般浓度达不到1μg/μL。根据1U酶切1μg质粒的原则，这一酶量是足够的。）
1%琼脂糖回收胶回收（碎胶、酚氯仿抽提法）
1. 酶切产物加入10％量的上样Buffer，混匀。使用1%的琼脂糖回收胶，电泳回收酶切产物。
2. 用手术刀切下所需要的大片断（载体）和小片断（插入片断），收入一个1.5mL离心管中。 （提示 切胶前，需用分别含酒精、NaOH和双蒸水的纸巾擦拭凝胶接触的台面，以防污染。 手术刀要火焰消毒，而后切胶回收。）
3. 12000rpm 1分钟，将凝胶甩到管底。 -20℃ 冰冻20分钟。
4. 取200μL Tip 头两只，在酒精灯上稍烤化Tip头尖端，两Tip头尖相对来回相接触，在Tip头顶部制成直径3mm左右的平头，准备用于碎胶。
5. 从-20℃取出冻结的凝胶，立即使用200μL枪套上平头Tip头，捣碎凝胶。（提示 200μL的枪足够粗壮，不要用100μL的枪，小心折断！！！ 乘凝胶比较硬时就开始碎胶，轻而频率高地捣碎凝胶）
6. 凝胶管中加入500μL双蒸水，盖紧，振摇200下。
7. 加入500μL Tris饱和纯酚，盖紧，振摇200下。 12000rpm 4℃ 离心15分钟。
8. 在一新1.5mL 离心管中加入 500μL 氯仿：异戊醇（24：1），将步骤7的上清加入本步骤离心管中。盖紧，振摇200下。 12000rpm 4℃ 离心5分钟。
9. 在一新1.5mL 离心管中加入 900μL 预冷 无水乙醇、20μL 3M的醋酸钠。将步骤8的上清小心加入本步骤离心管中。颠倒数次混匀。12000rpm 4℃ 离心15分钟。（提示 吸取步骤8中的上清时，千万不要将有机相吸入，宁可放弃一些上清，否则影响后面的连接反应。 另外，本方法使用的醋酸钠量较小，但足够沉淀核酸，并且无需洗盐。）
10. 弃上清，将离心管倒置于干净吸水纸巾上5分钟。室温下吹风干燥。（提示 可将试管至于超净台吹风干燥。如果管底有较多液体聚集，可盖好管盖后，轻弹管底数次，将液体分散挂在管壁上，再打开管盖吹风。）
连接
向回收DNA的试管中加入8μL 双蒸水，盖紧，弹击管底使液体尽量接触管壁。瞬时离心将液体甩到管底，再加入1μL ligase Buffer，1μL T4 ligase（连接酶）。弹击管壁混匀，瞬时离心将液体甩到管底。 置4℃过夜。 （提示 Ligase Buffer应该在首次融解后分装，每管可2-3μL，-20℃存储。 4℃过夜可获得最多的转化克隆。）
二、PCR产物接入质粒的克隆
简介： 取100μL PCR产物，酒精沉淀、干燥，直接加入酶切体系酶切；将用作载体的质粒A（制作大片断）酶切3μL；切胶回收来自质粒A的大片段，和来自PCR产物的小片断，并回收到一管中；酚氯仿法回收DNA，酒精沉淀，干燥；加入8μL水、1μLligase Buffer、1μL ligase ，4℃过夜；次日转化涂板。
PCR产物回收
1. 制备100μL PCR产物。
2. 将100μL PCR产物加入一1.5mL离心管中，再加入400μL双蒸水，颠倒混匀。加入 900μL 预冷 无水乙醇、20μL 3M的醋酸钠。颠倒数次混匀。（提示 本方法使用的醋酸钠量较小，但足够沉淀核酸，并且无需洗盐。）
3. 4℃静置30分钟，以利于核酸沉淀。
4. 12000rpm 4℃ 离心15分钟，沉淀核酸。
5. 弃上清，将离心管倒置于干净吸水纸巾上5分钟。室温下吹风干燥。（提示 可将试管至于超净台吹风干燥。如果管底有较多液体聚集，可盖好管盖后，轻弹管底数次，将液体分散挂在管壁上，再打开管盖吹风。）
酶切
直接在回收PCR产物的试管中配置酶切体系：
PCR产物酶切－制作插入片断
公用Buffer 6μL
酶 I 3μL
酶 II 3μL
PCR产物 ——
双蒸水 48μL
合计 60μL
要将PCR产物接入的质粒载体A，取A质粒3μL进行酶切。
A质粒酶切－制作载体片断
公用Buffer 3μL
酶 I 1μL
酶 II 1μL
质粒 3μL
双蒸水 22μL
合计 30μL
混匀。37℃，酶切3小时。
1%琼脂糖回收胶回收（碎胶、酚氯仿抽提法）
1. 酶切产物加入10％量的上样Buffer，混匀。使用1%的琼脂糖回收胶，电泳回收酶切产物。
2. 用手术刀切下所需要的大片断（载体）和小片断（插入片断），收入一个1.5mL离心管中。 （提示 切胶前，需用分别含酒精、NaOH和双蒸水的纸巾擦拭凝胶接触的台面，以防污染。 手术刀要火焰消毒，而后切胶回收。）
3. 12000rpm 1分钟，将凝胶甩到管底。 -20℃ 冰冻20分钟。
4. 取200μL Tip 头两只，在酒精灯上稍烤化Tip头尖端，两Tip头尖相对来回相接触，在Tip头顶部制成直径3mm左右的平头，准备用于碎胶。
5. 从-20℃取出冻结的凝胶，立即使用200μL枪套上平头Tip头，捣碎凝胶。（提示 200μL的枪足够粗壮，不要用100μL的枪，小心折断！！！ 乘凝胶比较硬时就开始碎胶，轻而频率高地捣碎凝胶）
6. 凝胶管中加入500μL双蒸水，盖紧，振摇200下。
7. 加入500μL Tris饱和纯酚，盖紧，振摇200下。 12000rpm 4℃ 离心15分钟。
8. 在一新1.5mL 离心管中加入 500μL 氯仿：异戊醇（24：1），将步骤7的上清加入本步骤离心管中。盖紧，振摇200下。 12000rpm 4℃ 离心5分钟。
9. 在一新1.5mL 离心管中加入 900μL 预冷 无水乙醇、20μL 3M的醋酸钠。将步骤8的上清小心加入本步骤离心管中。颠倒数次混匀。12000rpm 4℃ 离心15分钟。（提示 吸取步骤8中的上清时，千万不要将有机相吸入，宁可放弃一些上清，否则影响后面的连接反应。 另外，本方法使用的醋酸钠量较小，但足够沉淀核酸，并且无需洗盐。）
10. 弃上清，将离心管导致于干净吸水纸巾上5分钟。室温下吹风干燥。（提示 可将试管至于超净台吹风干燥。 如果管底有较多液体聚集，可盖好管盖后，轻弹管底数次，将液体分散挂在管壁上，再打开管盖吹风）
连接
向回收DNA的试管中加入8μL 双蒸水，盖紧，弹击管底使液体尽量接触管壁。瞬时离心将液体甩到管底，再加入1μL ligase Buffer，1μL T4 ligase（连接酶）。弹击管壁混匀，瞬时离心将液体甩到管底。 置4℃过夜。 （提示 Ligase Buffer应该在首次融解后分装，每管可2-3μL，-20℃存储。 4℃过夜可获得最多的转化克隆。）
三、 一步法感受态细胞制作（已经检验过DH5α 和BL21系菌，采用此方法的转化效率足够高）
来自Nucleic Acid Research 1988 16Musical Note 3580
Rapid and Convenient method for the preparation and storage of competent bacterial cells.
Chung CT, Miller RH.
1. LB medium 培养至 OD值 0.3-0.5。
2. 4℃ 3000g（或6000rpm） 5分钟。弃上清，收菌。
3. 重悬于原培养体积1/10的TSB中。
4. 冰上置10分钟。 分装，每管60μL，置冰上。放入－70℃冰箱。（提示 每次使用拿出一管，避免反复冻融。 －70℃可保存一年不影响转化效率）
TSB配方（需高压）：
LB （PH6.1）
10% PEG 3350
5% DMSO
10mM MgCI2
10mM MgSO4
10％ 甘油
~undefined TSB 的配置同原文稍有改动，即把甘油加入TSB并一起高压（简化步骤）。实践数次证明对于感受态制备没有影响。
5×KCM溶液配方：（配置数毫升即可，－20 ℃保存，可反复冻融）
0.5 M KCI
0.15M CaCl2
0.25M MgCI2
转化Protocol：
1. 连接产物10μL、5×KCM溶液10μL、双蒸水30μL，（共50μL）混匀，置冰上。
2. 从-70℃冰箱中取 1支感受态细胞，置冰上。融化后立即取50μL，加入步骤1中的混合液中，轻轻吹打数次混匀（不可用力过大，不可涡旋）， 立即置冰上。
3. 冰上放置20 分钟。
4. 室温放置10分钟。
5. 加入500μL新鲜LB， 150转37 ℃ 1小时。
6. 6000转/分 5分钟离心收菌。留150μL上清（其余上清丢弃），吹打数次，重悬菌体。
7. 涂板。 37 ℃ 孵箱过夜。
（提示：可使用质粒转化该感受态细菌，检验转化效率。1μL的质粒转化，DH5α菌板满板不可计数；BL21菌板有200－300个菌落。）
小结：
本方法采用简洁的步骤。最有特点的地方是片断回收后收到一个试管中，而不象一般的操作分别收到不同的试管中，回收后再电泳定量，并计算大小片断的比例，最后配置连接体系。
这种简洁的步骤不仅提高效率、避免引入人为的误差（例如肉眼对DNA的定量的误差），还减少了DNA的损失，保证了更多的DNA（实际上是全部的DNA）进入下面的连接反应。
所以本方法的第一个优点，是保证连接和转化中，有“足够量”的核酸。 连接和转化的核酸量得到保证，克隆成功就得到保证。
例如本方法中，制作大片断的A质粒取3μL，对于通常的小提质粒，3μL意味者600－1800ng的DNA。一般认为大片段的适当范围是50－200ng/10μL连接反应。本方法即使在回收过程中损失一半，仍然剩300－900ng。
实际上，使用本方法，在片断平移的克隆中，如果把转化的菌液全部涂板，得到的克隆多得不可计数；片断平移克隆实际上只取一半转化菌涂板即可。 PCR接入载体的克隆效率没有那么高，但是一般也达到40－60转化子/平板。
本方法的另一优是：这些看起来固定的步骤，例如酶切、酶连、以及转化等方案，实际上已经遵循了很多原则，而且这些步骤之间互相平衡，组成一个很稳定和可操作性很强的系统。
例如起始酶切A质粒和B质粒的量——3μL：7μL，已经隐含了载体：插入片断＝1：2~3的比例（PCR克隆经折算后大概是1：5~10）。即使加上DNA回收中会损失、大片断和小片断回收效率不同、酶切质粒同酶切PCR效率不同等影响因素，最后回收在试管中的大小片断比例仍然可以落在一个合适的范围内。
酶切使用的酶量，是经过计算的。可以保证是采用3－5倍的量切割质粒或PCR片断，因此可以保证酶切反应的效率。
连接反应在4℃下可以达到最大的转化率。实际上对于大多数粘端突出3碱基的酶切位点，18 ℃ 3小时已经足够。
Nucleic Acid Research上登载的感受态菌制备方法，可以得到效果很稳定的感受态细胞。每微克DNA可获得10的八次方个转化子。
因此，这套方法考虑到了克隆的每个重要环节，并以可靠的手段将这些环节“固定”下来。这套方法对于操作者和试剂带来的波动也有很好的“容错”能力，或者说，它的系统冗余比较大，保证了这套方法极高的成功率。
