氨基酸营养缺陷型突变株的筛选

一、目的要求

了解营养缺陷型突变株选育的原理。

学习并掌握细菌氨基酸营养缺陷型的诱变、筛选与鉴定方法。

二、基本原理

营养缺陷型是指野生型菌株由于某些物理因素或化学因素处理，使编码合成代谢途径中某些酶的基因突变，丧失了合成某些代谢产物(如氨基酸、核酸碱基、维生素)的能力，必须在基本培养基中补充该种营养成分，才能正常生长的一类突变株。

这类菌株可以通过降低或消除末端产物浓度，在代谢控制中解除反馈抑制或阻遏，而使代谢途径中间产物或分支合成途径中末端产物积累。

在氨基酸、核苷酸生产中已广泛使用营养缺陷型菌株；也可用于遗传学分析、微生物代谢途径的研究及细胞和分子水平基因重组研究中作为供体和受体细胞的遗传标记(如鼠伤寒沙门氏菌组氨酸和生物素缺陷型的突变株TAl535： his-,bio-,ΔuvrB,rfa )。

营养缺陷型筛选一般分四个环节，即诱变剂处理、营养缺陷型浓缩、检出和鉴定。诱变处理突变频率较低，只有通过淘汰野生型，才能浓缩营养缺陷型而选出少数突变抹。浓缩营养缺陷型有青霉素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法四种。检出营养缺陷型也有逐个测定法、影印培养法、夹层培养法和限量补给法四种。鉴定营养缺陷型一般采用生长谱法。

本实验选用亚硝基胍(NTG)为诱变剂，在碱性时NTG 能形成重氮甲烷(CH2N)、烷化DNA 而使基因突变：pH 5~ 5.5 时，NTG 形成HNO2，本身也是诱变剂；pH 6.0 时，NTG 本身不变化，可作用于核蛋白而引起诱变效应。

NTG 是—种超诱变剂，杀菌力较弱，诱变作用较强，其作用部位又往往在 DNA的复制叉处，易造成双突变。一般选用NTG 处理时，诱变频率较高，可使百分之几十的细菌发生营养缺陷型突变，筛选营养缺陷型时，可省去浓缩缺陷型这一环节

三、实验材料

(一) 菌种

棒杆菌T6-13(谷氨酸产生菌)。

(二) 培养基 配制法见附录。

1. 细菌完全培养基(简称CM)

固体和液体。

2. 细菌基本培养基(简称MM)

固体和液体。

3. 无氮基本培养基

在基本培养基中不加(NH 4 ) 2 SO 4 (液体)。

4. 2 倍氮源基本培养基

在基本培养基中加入2 倍(NH 4 ) 2 SO 4 (液体)

5. 补充培养基(简称SM)

为满足某特定营养缺陷型菌株的营养要求而在基本培养基中加入某—种或几种营养成分的培养基称补充培养基。

注：配制基本培养基的药品均用分析纯，使用的器皿应洁净，需用蒸馏水冲洗2~3 次，必要时用重蒸水冲洗。

琼脂是从一种海藻中提取的聚半乳糖的的硫酸酯，除含少量的钙、镁、钠、钾等矿物质外，还含有少量蛋白质、维生素等营养成分，需用洗涤处理过的琼脂，否则会影响营养缺陷型的筛选结果。洗涤琼脂的方法有两种：

(1) 将500 g 琼脂放于大玻璃缸内，加5 L 蒸馏水和500 mL 氮苯浸泡24 h，然后滤去氮苯液和水，再用蒸馏水洗涤琼脂三次，用95%的酒精洗涤琼脂一次，用95%酒精浸泡琼脂过夜，滤去酒精，再用水洗，最后把洗过的琼脂在纱布上展成薄层晾干。处理过程约需10 d。

(2) 把琼脂放在玻璃缸内，用流水洗涤、并浸泡6~7d，用奈氏试剂检查无铵离子存在时，再用纱布包起来，将水滤干，最后展成薄层晾干备用。