经典Lowry–Folin法测定液体样品中蛋白质含量

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一、 实验目的

1、 了解测定蛋白质的常用方法

2、 掌握蛋白质含量测定的经典Lowry – Folin法。

二、 实验原理

在碱性溶液中，蛋白质中的肽键与铜盐可产生双缩脲反应，产生络合物，此络合物会将磷钼酸-磷钨酸试剂还原，产生深蓝色复合物。在一定的条件下，蓝色深浅与蛋白质的量成正比。在波长540nm处测定样品的吸光度，与标准曲线对比，可确定其蛋白质含量。这种方法是检测可溶性蛋白质含量最灵敏的经典方法之一。

三、 实验步骤

1、 标准曲线的绘制

(1) 取10ml具塞试管6支，编号，分别准确吸取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00ml血清蛋白溶液置于相应的试管中，在各试管中分别加入1.00、0.80、0.60、0.40、0.20和0.00ml的蒸馏水，使总体积达到1.00ml。不同浓度BSA 溶液的配置

(2) 取试剂A15.00ml，试剂B0.75ml和试剂C0.75ml，在50ml三角瓶中混匀，在每只试管中分别准确加入此试剂1.00ml，充分摇匀，静置15min.

(3) 分别在各试管中准确加入Folin-酚试剂稀释液3.00ml，立刻震荡，充分摇匀。

(4) 静置30min，在540nm波长下测定每个试管中溶液的吸光度(A值)。

(5) 以A值为纵坐标，BSA 质量(即0~200µg)为横坐标，绘制标准曲线，求出回归方程和相关系数R2。

2、 样品的测定

将啤酒样品适当稀释(20倍)，吸取2份，各1.00ml，重复步骤1中的(2)~(4)。

四、 实验试剂

1、 试剂A：称取Na2CO3100.0g溶于1000ml(最终体积)0.5mol/LNaOH中。

2、 试剂B：称取CuSO4·5H2O1.0g溶于100ml(最终体积)蒸馏水中。

3、 试剂C：称取酒石酸钾钠2.0g溶于100ml(最终体积)蒸馏水中。

4、 牛血清蛋白 (BSA)标准溶液：准确称取牛血清蛋白，配制成浓度为200µg/ml的溶液。

5、 2mol/LFolin-酚试剂。

五、 实验数据与处理

样品中蛋白质的含量(µg/ml) = XA Ⅹ N Ⅹ 0.001

式中，XA——根据标准曲线计算出来的蛋白质量(对应稀释样品中的蛋白质浓度，µg/ml) N——样品的稀释度数(N=20)

计算：标准曲线 y = 0.0017x + 0.0078(R2=0.9957)

当y1=0.172时，代入得x1=96.59(µg/ml)样品1中蛋白质含量m1=1.93mg/ml

当y1=0.172时，代入得x1=96.59(µg/ml)样品1中蛋白质含量m1=1.93mg/ml

当y2=0.164时，代入得x2=91.88(µg/ml)样品2中蛋白质含量m2=1.84mg/ml

平均含量：(1.93+1.84)/2=1.885 mg/ml

平均偏差：(1.93-1.84)/2 = 0.045

相对平均偏差：0.045/1.885 Ⅹ 100% = 2.39%

六、 实验注意事项

1、 加入Folin-酚试剂后立即将反应液摇匀，以便Folin-酚试剂在碱性溶液中破坏之前即能被铜-蛋白质复合物还原。

2、 短时间内反应液的颜色保持稳定，因此，静置30min后应立即测定吸光度，若拖延时间过长，颜色将会变化，影响测定结果。

七、 思考题

1、 测定食品中蛋白质含量的常用方法有哪些?其原理、适用性如何?

答：①凯氏定氮法

原理：样品与浓硫酸共热，含氮有机物即分解产生氮(消化)，氮又与硫酸作用，变成硫酸氢。经强碱碱化使之分解放出氢气，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品的氮含量，再乘以6.25，即得样品中蛋白质含量，以甘氨酸为例，反应式为：

NH2CH2COOH + 3H2SO4——2CO2+3SO2+4H2O+NH3

2NH3+H2SO4——(NH4)2SO4

(NH4)2SO4+2NaOH——2H2O+NaSO4+2NH3

适用性：用于标准蛋白质含量的准确测定，干扰少，费事太长;灵敏度低，适用于0.2~1.0mg氮，误差为±2%。

②双缩脲法

原理：在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或连个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测量蛋白质含量。

适用性：用于快速测定，但不太灵敏;不同蛋白质显色相似;误差范围为1~10µg蛋白质

③Folin-酚试剂法

原理：在碱性溶液中，蛋白质中的肽键与铜盐可产生双缩脲反应，产生络合物。此络合物会将磷钼酸-磷钨酸试剂还原，产生深蓝色复合物。在一定的条件下，蓝色深浅与蛋白质的量成正比。在波长540nm处测定样品的吸光度，与标准曲线对比，可确定其蛋白质含量。

适用性：耗时长，操作要严格计时;颜色深浅随不同蛋白质变化，灵敏度高;最低位0~5µg;通常测定范围是20~250µg;也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。

④紫外吸收法

原理：蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有紫外吸收的性质，吸收峰在280nm处，其吸光度与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在280nm时的吸光度值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的吸光度值与蛋白质浓度的正比关系，可进行蛋白质含量的测定。

适用性：用于层析注流出液的检测;较为灵敏50~100µg;适用于与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。

⑤考马斯亮蓝法

原理：考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使燃料的最大吸收峰位置λmax，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色，在595nm下测定的吸光度值，与蛋白质浓度成正比。

适用性：干扰物质少，颜色稳定，颜色深浅随不同蛋白质变化;灵敏度最高为1~5µg。

2、 使用分光光度计时应注意哪些问题?

答：分光光度计特点：准确度高，测量范围广，在一定条件下可同时测定水样中两种或两种以上的物质组成含量。

注意：

①使用前，仔细阅读其使用说明书;

②若大幅度改变测试波长，需稍等片刻，等灯热平衡后，重新调零及满度后，再测量;

③指针式仪器在未接通电源时，电表的指针必须位于零刻度，若不是，则需进行机械调零;

④操作人员不宜轻易触动灯泡及反光镜灯，以免影响光效率;

⑤放大其灵敏度换挡后，必须重新调零;

⑥比色皿使用时需注意方向性，并应配套使用，以延长其使用寿命，使用完毕后，应立即用蒸馏水冲洗干净，并用干净柔软的纱布擦水迹，以防表面光洁度被破坏。