血清r球蛋白的分析测定－盐析法

[目的与原理]

应用盐析法测定血清r球蛋白含量。

在血清中加入适量的硫酸铵及氯化钠溶液，使混合后此两种盐类的浓度分别为18.5％及2.9%，溶液的pH调节至r球蛋白的等电点（pH6.4），此时r球蛋白沉淀析出而其它蛋白质则留于溶液中。离心除去上清液，将沉淀溶于氯化钠溶液中，用双缩脲法测定蛋白质的量，此为血清r球蛋白含量

[ 试剂与器材]

试剂 ：

1、硫酸铵—氯化钠溶液：称取硫酸铵（A.R.或C.P.）195g及氯化钠（A.R.或C.P.）29.3g，溶于蒸馏水约700ml中。试测pH并用氨水或硫酸溶液调节pH至6.4（如准确测定pH有困难，这一步骤可省去）。将溶液全部转移入1L容量瓶中，用蒸馏水稀释至1L刻度。

2、0.9％氯化钠溶液：称取氯化钠9.0g, 用蒸馏水溶解并稀释至1L。

3、双缩脲试剂：见《血清（浆）总蛋白测定》。

4、标准血清：见《血清（浆）总蛋白测定》。

器材：

可见分光光度计，离心机， 试管若干及试管架，旋涡混合器，500ml塑料试剂瓶，1L容量瓶，烧杯 2个，吸管若干支，滤纸，擦镜纸。

[实验步骤]

1、吸取硫酸铵—氯化钠溶液5.7ml，置于15ml尖底 离心管 中，加入血清标本0.30ml加塞，轻轻混和数次，然后将 离心管 放入冰 水浴 中15分钟。离心（3000转/分）10分钟。

吸去上清液，再离心5分钟。用滤纸条将残留的液体尽量吸干，因为较多的硫酸铵可影响双缩脲显色，加入0.9％氯化钠溶液2.0ml，轻轻摇动使沉淀溶解，必要时可用细玻璃棒搅拌。此管即为“测定管”。另取同样的离心管2只，分别加入0.9％氯化钠溶液2.0ml，作为“空白管”及“标准管”

2、3管中各加入双缩脲试剂8.0ml，混和，在室温放置30分钟，用540nm或绿色滤光片进行比色，以空白管校正光密度到0点，读取各管光密度读数。

3、计算

将所得光密度按下列公式计算r球蛋白量

血清 r球蛋白（g/100ml）=测定管光密度/标准管光密度 × 0.1/0.3×标准 血清 蛋白含量。

[方法评估]

本方法用盐析法直接测定血清r球蛋白量，方法简便，稳定。与电泳法结果相似。但目前应用较为普遍的是电泳方法，其分离谱带成分多，样品用量少。

[应用意义]

血清蛋白可看作是 抗体 蛋白，其含量变化与机体免疫状态有关。

[注意事项]

1、本测定时先应熟悉双缩脲法的特点。如r球蛋白含量较高，测定管光密度超过标准曲线的直线范围，可用双缩脲试剂稀释液（双缩脲试剂8份加0.9％氯化钠溶液2份）进行稀释后再作测定，并将测得的结果乘以稀释倍数。

2、本法不适用于测定血浆的r球蛋白，因血浆中的纤维蛋白原将与r球蛋白一并沉淀。