硫酸铵盐析法

分离纯化蛋白质，首先要从原材料中提取目的蛋白，然后通过粗分离的方法除去大量杂质，最后进行精细分离，得到目的蛋白。本实验以新型基因重组人TNF为例阐明重组蛋白TNF的提取及初步分离。
 

TNF的提取是将发酵菌体裂解，在一定的条件和溶液中，使被提取的TNF充分释放出来，经离心收集混合液中提取的TNF成份的过程。含有TNF的提取溶液中，含有大量的杂蛋白，由于蛋白质在水溶液中的溶解度主要取决于蛋白质分子表面的水分子数目，即蛋白质表面亲水基团与水分子形成水化膜的程度和带电荷的情况，当中性盐如硫酸铵等加入蛋白质溶液时，由于中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，使蛋白质分子周围的水化膜减弱或消失，蛋白质溶解度降低，同时由于中性盐的加入，蛋白质溶液的离子强度发生了改变，蛋白质表面电荷被大量中和，更加导致蛋白质溶解度降低，使蛋白质分子之间互相聚集而发生沉淀。不同的蛋白质由于其带电性，亲水性等性质的不同，会在不同浓度的盐中形成沉淀。依此原理可对混合蛋白质进行粗分离。该实验中利用硫酸铵盐析除去大部分杂蛋白从而使TNF得到初步纯化。

一、试剂配制
 

1.  STE（25%蔗糖  10 mmol/L Tris-HCl pH 8.5 1 mmol/L EDTA）

 蔗糖       250 g

1 mol/L Tris.HCL   10 ml

0.5 mol/L EDTA     2 ml，加水至1 000 ml

115℃，20 min高压灭菌

2.  1mol/L  MgCl₂

取  MgCl₂  203.30 g，加水至1 000 ml
 

3.  Tris-HCL  pH8.5

取Tris  121.14 g

用HCL调pH至8.5，加水至1 000 ml

（12 mol/L  HCL约30 ml）
 

4.  0.5 mol/L EDTA pH8.5

乙二氨四乙酸二钠      186.12 g

NaOH  20 g，加水至1 000 ml

121℃，20 min高压灭菌
 

二、操作步骤
 

1.  称取菌体重量，按5~10 ml/g菌体加入STE溶液，搅拌至菌体完全悬浮。
 

2.  按0.5~1 mg/g菌体加入用STE溶液新鲜配制的溶菌酶溶液，用玻璃棒用力搅匀后于4℃环境中放置20 min。此时菌液呈粘稠状。
 

3.  按10 mg/g菌体加入用STE溶液新鲜配制的脱氧胆酸钠（DOC）溶液，用力搅匀。
 

4.  加入5~10 ml 1 mol/L MgCl₂溶液，搅匀后加入约40 μl Dnase I（25 mg/ml）充分搅拌至菌液变稀。
 

5.  15 000 rpm，4℃离心30 min。
 

6.  取离心上清，精确量取其体积，测定蛋白质浓度，倒入置于冰浴的烧杯中，边搅拌边缓慢加入固体硫酸铵使其达到50%饱和度。待固体硫酸铵安全溶解后，静置于0℃环境中30 min。
 

7.  离心，15 000 rpm，4℃，30 min。取离心上清，量其体积，测定蛋白浓度。
 

8.  将离心上清装入透析袋，4℃搅拌在pH8.5 20 mmol/L Tris-Hcl，1 mmol/L EDTA溶液中透析。
 

加入硫酸铵不论是固体硫酸铵，还是加入饱和硫酸铵溶液，加入时应边加入边搅拌，特别注意① 加入硫酸铵要慢，因为太快会引起蛋白质发生共沉淀，加入固体硫酸铵时事先要将硫酸铵研磨成粉末，加入饱和硫酸铵溶液时要一滴一滴地加入；② 搅拌要慢，搅拌剧烈，蛋白质溶液容易起泡沫，由于表面张力效应会引起蛋白质变性。