不连续SDS-PAGE

一、原理及目的

（略）

二、试剂

1、30%丙烯酰胺贮存液：29g丙烯酰胺和1g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于100ml热水中，验证其pH值不大于7.0。置棕色瓶中，4℃保存。

2、1.5mol/L Tris（pH8.8）溶液

3、10% SDS溶液

4、10%过硫酸铵：新鲜配制

5、TEMED溶液：4℃保存

6、1.0 mol/L Tris（pH6.8）溶液

7、2×样品溶解液：2%SDS，5%巯基乙醇，10%甘油，0.02%溴酚蓝，0.01mol/L Tris-HCl（pH8.0）缓冲液。

8、5×Tris-甘氨酸电极缓冲液：每1000ml该溶液中，含15.1g Tris，94g甘氨酸和50ml 10%（W/V）SDS贮存液。

9、固定液：冰乙酸：甲醇:水=1：2：7

10、考马斯亮蓝R染色液：每100ml甲醇、水、冰乙酸混合物（9：9：2）中，溶解0.25g考马斯亮蓝R，过滤除去未溶物。

11、脱色液：甲醇：水：冰乙酸=9：9：2

注：1、2、5、6、7由教师提供，其余由学生自己配制，其中8可在凝胶凝固的过程中配制，9、10、11在电泳时配制。

三、操作步骤

1、准备步骤

1）将凝胶板依次用水、SDS、水、无水乙醇、水洗涤干净，然后使其自然风干或烘干。

2）试样格（梳子）临用前用无水乙醇擦拭，让其挥发至干。

3）灭菌枪头、eppendorf管。

2、制备凝胶

1）安装玻璃板、板条，并将玻璃板固定在电泳槽中，以5%琼脂封底。

2）配制10%的分离胶（20ml）：依次将8ml蒸馏水，6.7ml 30%丙烯酰胺贮存液，5ml 1.5mol/L Tris（pH8.8）溶液，0.2ml 10% SDS溶液，0.2ml 10%过硫酸铵，0.008mlTEMED混合，立即灌胶。

3）迅速在两玻璃板间隙中灌注分离胶，直至剩余的板宽比梳子长度多1cm。小心在胶上覆盖一薄层正丁醇。

4）在分离胶聚合的过程（约40分钟）中，配制5%的积层胶（8ml）：依次混合5.5ml蒸馏水，1.3ml 30%丙烯酰胺贮存液，1.0ml 1.0 mol/L Tris（pH6.8）溶液，0.08ml 10% SDS溶液，0.08ml 10%过硫酸铵，0.008TEMED。TEMED应在灌胶前才加入。

5）分离胶聚合完全后，倒去正丁醇，用蒸馏水冲洗胶面数次，用滤纸吸干胶面上的残余水。

6）灌注积层胶，立即插入干净的梳子，避免产生气泡。

7）积层胶聚合完全后，小心拔出梳子，用移液器吸取电极缓冲液清洗加样孔数次，以除去未聚合的丙烯酰胺。

8）在上下电泳槽中加入足够的电泳缓冲液。

3、样品的制备

在蛋白溶液中加入等体积的2×样品溶解液，使蛋白的终浓度为3～4mg/ml，混合液在沸水浴中加热3分钟，冷却后即可上样。

4、上样

用微量进样器上样，每加入一种样品，应在下槽中洗涤加样器数次，最后在空白加样孔中加入等体积的SDS样品溶解液。

5、电泳

装好冷凝水系统，打开电源，初始电压为100～120V，当染料进入分离胶（这段时间约为20min）后，将电压提高到200～220V，继续电泳直至染料到达离凝胶底部1cm处。

6、后处理

1）固定：从电泳装置上卸下玻璃板，用镊子小心撬开玻璃板，除去积层胶部分，将分离胶移入固定液（固定液的量至少为胶体积的5倍）中固定，直至染料由蓝绿色变为黄色。

2）染色：除去固定液，加入染色液（用量同上），室温染色8小时或60℃染色2小时。

3）脱色：回收染色液，将凝胶浸泡于脱色液中，直至背景脱至无色，其间更换脱色液3～4次。

四、结果

绘制蛋白图谱，并对其进行必要说明。

五、注意事项

N，N’-亚甲双丙烯酰胺为神经毒性物质，可经皮肤直接吸收，使用时应避免其直接接触皮肤，必要时应戴手套。但其凝固后就变成无毒物质。