不连续非变性凝肢电泳

非变性凝胶电泳通常是在高 pH（8.8）缓冲液条件下进行。这时，多数蛋白质带负电荷，并向阳极迁移。

1. 工作溶液配制

2. 工作溶液用量

（1）制备不同厚度电泳凝胶所需的溶液体积

制备两块 6 cm×8 cm 的凝胶

配制量应比实际用量稍多些。

（2）X％ 分离胶的计算

3. 制备分离胶

（1） 按操作指南装配好灌胶用的模具；

（2） 将 A 液、B 液和水在小的三角瓶或试管中混合（由于丙烯酰胺具有神经毒性。 应戴手套操作）；

（3） 在温和搅拌下，加入过硫酸铵，TEME 混匀。由于这一步中发生聚合，动作要迅速；

（4） 将上述胶液用滴管移入凝胶模具；

（5） 加完分离胶后，立即轻轻在其顶部覆盖 1～5 mm 的水垣；

（6） 静置 30～60 min，待凝胶聚合；当凝胶聚合后，在分离胶和水层之间将出现一个明显的界面，这时将凝胶稍微倾斜。 判断凝胶是否聚合。

4. 堆积胶的制备

（1） 除去覆盖在分离胶上的水层；

（2） 在小三角烧瓶或试管中，将 A 液，C 液和蒸馏水混合；

（3） 在温和搅拌下，加入过硫酸铵和 TEMED，混合均匀；

（4） 吸取堆积胶溶液加到分离胶之上，直至溶液到达前玻璃板的顶部。

（5） 将梳子小心的插入到两块板之间，直至梳子齿底部到达前玻璃板的顶部，在梳子齿端避免留下气泡。

（6） 放置 30 min，堆积胶可聚合；

（7） 待堆积胶聚合后，小心的取出梳子，不要使加样孔裂缝；

（8） 将凝胶置入电泳槽中，并接好正负电极；

（9） 将电泳缓冲液加入内外电泳槽中。 确保凝胶的上部和底部都浸在缓冲液中。

5. 样品制备

（1）加样孔的样品容量（Mini-Gel 系统）

（2） 将蛋白质样品和样品缓冲液（20 ul + 5 ul）在 Eppendorf 管中混匀；

（3） 用微量注射器将样品加入加样孔中；

（4） 在加入不同的样品之前。用注射器抽吸少量的电泳缓冲液冲洗注射器，以避免样品间的相互污染。

6. 电泳

（1） 将电极插头与适当的电极相接，对于体育 pH 8.8 的凝胶，电流应流向阳极；

（2） 将电压调至 100～200 V；

（3） 电泳值示踪染料的前沿迁移到距凝胶底部约 1～5 mm处；

（4） 关闭电源；

（5） 拔掉电极插头；

（6） 取出电泳凝胶板，放在一个安全的地方，轻轻撬开凝胶两边的玻璃板，使胶粘在其中的一块板上。

7. 凝胶染色

（1） 戴手套，将凝胶转移到一个含有约20 ml考马斯亮蓝的培养皿内；

（2） 在摇床上缓慢震荡，0.75 mm 的胶需要 5～lO min。1.5 mm 的凝胶需要 10～20 min，；

（3） 去除染液；

（4） 加入约 50 ml 脱色液，继续轻微震荡；

（5） 为了脱色完全，需数次更换脱色液并震荡过夜；可进行干胶保存。