正常动物肺肥大细胞的培养
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实验材料:
1. 正常动物的肺组织;
2. 不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS,添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素,pH7.2;
3. TE液:Tyrode液加入2 mmol/L EDTA。Tyrode液含137 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、0.36 mmol/L NaH2PO4 、5.55 mmol/L 葡萄糖;
4. TEA液:TE液加入200mg/L氨苄青霉素、200mg/L庆大霉素和40mg/L甲硝唑;
5. TGMD液:Tyrode液加入0.1%明胶、1.23 mmol/L MgCl2 和15mg/L DNA酶;
6. HA液:HEPES液补充0.25g/L不含脂肪酸的BSA。HEPES液含20 mmol/L HEPES、125 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl和0.5 mmol/L 葡萄糖;
7. HACM液HA液补充1 mmol/L CaCl2 和1 mmol/L MgCl2 ;
8. 消化液a:用TE液配成,含有3g/L链霉蛋白酶和0.75g/L木瓜凝乳蛋白酶;
9. 消化液b:用TGMD液配成,含有1.5g/L胶原酶和0.15g/L弹性蛋白酶;
10. Percoll溶液:配成密度为1.090 g/ml、1.080 g/ml、1.070 g/ml和1.062 g/ml的4种溶液;
11. 培养液:ROMI1640,添加10%FBS、50μg/L SCF、2 mmol/L 谷氨酰胺、0.1 mmol/L 非必需氨基酸、100000 IU/L青霉素和100mg/L庆大霉素。pH7.2;
12. 手术刀、解剖剪、解剖镊、眼科剪,眼科镊,止血钳,无菌消毒手术器械;
13. 离心管(15ml、50ml)
14. 网筛:300μm不锈钢网筛
实验方法:
1. 取肺组织10—40g,放入4℃的TEA液中,剥除支气管和血管后,将肺组织切成0.2—1g的小块,用TEA液冲洗2次;
2. 将肺组织剪碎,加入消化液a,在室温条件下消化20min。用孔径为300μm不锈钢筛网滤去已脱落下来的细胞。用TE液清洗组织块,加入消化液a,将组织块重复消化和过滤1次;
3. 用TGMD液清洗组织块后,加入消化液b,在30℃条件下消化20min。用孔径为300μm不锈钢筛网滤出组织块,收集滤液,在4℃条件下离心(400g,10min)。吸去上清液,用HA液混悬沉淀细胞,在4℃条件下保存;
4. 按操作步骤3重新操作1次,得到细胞悬液;
5. 将操作步骤3和4收集的细胞悬液混合,用孔径为100μm不锈钢筛网过滤,收集滤液,在4℃条件下离心(400g,10min)。然后,用4℃的HA液混悬沉淀细胞,再离心1次;
6. 用HACM液混悬细胞,调整细胞密度至0.5×106 —2×106 个/ml;
7. 在离心管中依次缓慢滴入密度为1.090 g/ml、1.080 g/ml、1.070 g/ml和1.062 g/ml的Percoll溶液。在1.062 g/ml的Percoll溶液中预先混入约1×107 个细胞。然后,在20℃条件下离心(500g,40min);
8. 在密度1.070与1.080、1.080与1.090两个Percoll溶液界面处收集细胞,用HA液混悬细胞,在4℃条件下离心(400g,10min)。然后,重复离心1次。
9. 用培养液混悬沉淀细胞,调整细胞密度至0.5×106 —2×106 个/ml,放37℃、5%CO2的培养箱中培养。24h后换液,以后每周换液1次;