正常大鼠皮肤肥大细胞的培养
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实验材料:
1. 正常大鼠(体重150g—250g)的皮肤;
2. 不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS,添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素,pH7.2;
3. 消化液:1g/L胶原酶和1g/L透明质酸酶(1 : 1, v/v )混合消化液,用含10mmol/L HEPES和20%FBS的HBSS配制;
4. 冲洗液:改良的Tyrode液,含137mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、0.36 mmol/L NaH2PO4、5.55 mmol/L 葡萄糖、10 mmol/L HEPES、1 mmol/L CaCl2 和1 mmol/L MgCl2 ;
5. 培养液:ROMI1640,添加10%FBS、25 mmol/L 谷氨酰胺、25 mmol/L HEPES、100000 IU/L青霉素和100mg/L庆大霉素。pH7.2;
6. 手术刀、解剖剪、解剖镊、眼科剪,眼科镊,止血钳;
7. 离心管(15ml、50ml)
8. 网筛:0.75mm不锈钢滤网
实验方法:
1. 乙醚麻醉后,放血处死动物。剃去腹部毛,用70%乙醇消毒。切开皮肤,剥取约3cm×4cm皮片。将皮片放入培养皿内,用冲洗液清洗3次;
2. 用刀片将皮片垂直切成约1mm2 小片,放入三角瓶中,然后加入20—25ml消化液,在培养箱内静止消化4h。将三角瓶移入恒温水浴振荡器内,37℃水浴中振荡消化45min;
3. 用吸管充分吹打组织块,再用孔径为0.75mm的不锈钢滤网滤出组织块。收集滤液,在4℃条件下离心(150g,5min)。吸去上清液,用预冷的冲洗液混悬沉淀细胞,离心(150g,5min)。用培养液混悬细胞,调整细胞密度,使混合细胞中肥大细胞达到2×105 个/ml。培养12h;
4. 轻轻摇晃培养皿,收集含有肥大细胞的培养液。然后,将细胞悬液加入培养皿中置于37℃、5%CO2 的培养箱中培养培养;