正常大鼠皮肤肥大细胞的培养

实验材料：

1. 正常大鼠（体重150g—250g）的皮肤；

2. 不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素，pH7.2；

3. 消化液：1g/L胶原酶和1g/L透明质酸酶（1 : 1， v/v ）混合消化液，用含10mmol/L HEPES和20%FBS的HBSS配制；

4. 冲洗液：改良的Tyrode液，含137mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、0.36 mmol/L NaH2PO4、5.55 mmol/L 葡萄糖、10 mmol/L HEPES、1 mmol/L CaCl2 和1 mmol/L MgCl2 ；

5. 培养液：ROMI1640，添加10%FBS、25 mmol/L 谷氨酰胺、25 mmol/L HEPES、100000 IU/L青霉素和100mg/L庆大霉素。pH7.2；

6. 手术刀、解剖剪、解剖镊、眼科剪，眼科镊，止血钳；

7. 离心管（15ml、50ml）

8. 网筛：0.75mm不锈钢滤网

实验方法：

1. 乙醚麻醉后，放血处死动物。剃去腹部毛，用70%乙醇消毒。切开皮肤，剥取约3cm×4cm皮片。将皮片放入培养皿内，用冲洗液清洗3次；

2. 用刀片将皮片垂直切成约1mm2 小片，放入三角瓶中，然后加入20—25ml消化液，在培养箱内静止消化4h。将三角瓶移入恒温水浴振荡器内，37℃水浴中振荡消化45min；

3. 用吸管充分吹打组织块，再用孔径为0.75mm的不锈钢滤网滤出组织块。收集滤液，在4℃条件下离心（150g，5min）。吸去上清液，用预冷的冲洗液混悬沉淀细胞，离心（150g，5min）。用培养液混悬细胞，调整细胞密度，使混合细胞中肥大细胞达到2×105 个/ml。培养12h；

4. 轻轻摇晃培养皿，收集含有肥大细胞的培养液。然后，将细胞悬液加入培养皿中置于37℃、5%CO2 的培养箱中培养培养；