分子标记技术在中药品种鉴别中的应用

现代分子生物学研究发现，中药材(不含矿物药)所依赖的生物资源――“物种”的多样性是由于其基因多态性的结果，而基因多态性可在分子水平上检测，它比在形态、组织和化学水平上检测更能代表其变异类型的遗传标记。传统的分子标记主要有血清学特征、蛋白质谱 、同工酶谱，近10年来则有迅速发展起来的DNA 分子标记，现介绍如下。

1 　传统的分子标记

1.1　抗血清　中药有许多具有抗原决定簇结构的大分子如多糖、蛋白质等，用它们制成特异性抗体(抗血清)进行中药定性定量分析是一种高度选择性的血清学检定方法，血清学特征对中药复方制剂(成药)中特定的药材(如动物药)鉴定上具有极大的开发利用价值。

有人报告，采用免疫化学方法鉴别虎骨、豹骨。又如有研究报告采用酶联免疫法(ELISA )确证出长牡蛎(Ostrea gigas)特征蛋白抗原，制备免疫抗血清成功地对中药复方制剂海王金牡蛎制剂(胶囊)中的药材牡蛎进行了鉴别和含量测定。其缺点是免疫测定试验周期长，所需动物量大等。

1.2　蛋白质　采用凝胶电泳技术进行蛋白质谱 带数目、宽窄、位置、以及染色程度分析，可获得很多信息，从而达到中药鉴别的目的。

如人参(Panax ginseng)和西洋参(Panax quinquefolius)及其5种伪品沙参、蔓生百部、桔梗、紫茉莉、商陆通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)图谱可以达到鉴别目的。但是蛋白质电泳图谱类型主要是依靠肉眼直观比较，人为区分的，在一定的程度上影响了结果的准确性。

1.3　同工酶　特点是同工酶的变异非常丰富，结构的差异直接来源于基因的差异，并能够稳定遗传。因此，用它可以鉴别许多从外部形态上难以区分的遗传变异。其次，由于同工酶分析系采用酶活性染色和电泳检测，非酶类成分不被显示，电泳图谱往往比蛋白质电泳图谱简洁、清晰。

缺点则是为防止酶失活，条件比蛋白质分析要求高。取样必须是新陈代谢活跃的部位，这也限制了同工酶分析方法在干燥药材鉴别上的应用。在中药鉴别方面，已有人参与西洋参的过氧化酶(POD)和酯酶(ES)的同工酶酶谱鉴定分析的报告。

2 　DNA 分子标记

因为上述传统分子标记存在一定的局限性和应用范围，DNA 分子标记技术的发展使中药的分子鉴别成为可能。在DNA 分子水平，限制性片断长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)被称为检测基因多态性的常规技术。

而其中建立在PCR技术基础上的DNA 指纹图谱法(DNA fingerprinting)和DNA 测序 法(DNA sequencing)则是90年代才发展起来的分子标记。

利用PCR从不同生物样品中人工合成DNA 片段，而这种DNA 片段的大小、数目可因不同的生物而异，故称之为“DNA 指纹图谱”。这种DNA 指纹技术具有重复性好、灵敏度高的优点。

由于DNA 分子标记直接分析的是生物的基因型而非表现型，所以鉴别结果不受环境因素、样品形态(原品、粉状或片状)和材料来源的影响，因此，可为中药品种鉴别提供更加准确可靠的手段。

2.1　RFLP标记　80年代中期才发展起来的DNA 片断分析技术RFLP不仅在生物学、医学、农学的许多领域都有了成功的应用，而且在中药材品种基原及其地理品系、栽培品系系的质量评价方面也已有了许多研究报道。

《日本药局方》收载的三岛柴胡(Bupleurum falcatum)是以日本九州为主要栽培地，但其为地理多样性品种。根据产地不同，叶序、染色体数目、皂苷含量均存在明显的差异。

日本名古屋市立大学水上元研究小组对日本8个产地野生的柴胡采用水稻rDNA 作探针，用限制性核酸内切酶Dra I，Kpn I，Taq I 酶解进行RFLP分析，结果发现秋吉台、平尾台、香春、汤布院为代表的山口北九州地理品系的RFLP与其它品系明显不同，这与形态学、细胞学、化学的研究结果相吻合。

对茅苍术(Atractylodes lancea)、北苍术(A.chinensis)、关苍术(A.japonica)和白术［A.ovata=A.macrocephala)(前两者日本作苍术用，后两者日本作白术用)］的挥发油化学成分分析发现，苍术类主要含苍术素(atractylodin)，而白术类主含苍术酮(atractylon)。

《日本药局方》以此成分的差异作为白术与苍术的理化鉴别依据。然而日本市售苍术商品药材中常含有白术的特异成分苍术酮，因此有人认为这是由于茅苍术和白术类植物杂交的结果。

水上元研究了日本和中国野生或栽培的术类19个地理品系，采用Dra I，Kpn I，Eco RV，Sac I 酶解，用上述同样的RFLP方法进行分析，发现日本栽培的茅苍术与中国产的RFLP几乎一致。虽然存在含较高苍术酮的茅苍术，但RFLP未显示出茅芬术与白术或关苍术的杂交谱带，这表明茅苍术存在种内变异。同时发现这3个种之间RFLP均有明显的差异，可资区别。

日本千叶大学山崎真已等采用RFLP方法分析羽扇豆属(Lupinus)5种药用植物白羽扇豆(L.albus)、黄羽扇豆(L.luteus)、多叶羽扇豆(L.polyphyllus)、埃及羽扇豆(L.termis)、毛羽扇豆(L.hirsutus)的亲缘关系及与其所含双稠哌啶类生物碱的相关性，结果表明RFLP可以区别这些羽扇豆属药用植物。

目前，人们感到RFLP技术在应用上很不方便，原因是费时费力，且仅限于作探针的基因长度。同时，与同工酶标记一样，RFLP分析技术要求新鲜的材料，难适用于干燥药材的鉴别。

2.2　PCR标记　PCR是一种模拟自然DNA 复制过程的体外酶促合成特异性核酸片断技术，又称无细胞分子技术。它以待扩增的两条DNA 链为模板，由一对人工合成的寡核苷酸引物介导，通过DNA 聚合酶促反应，在体外进行特异DNA 序列扩增。

PCR过程在经过变性、复性、延伸约30个循环能在2 h内将痕量的靶DNA 扩增数百万倍，具有操作简单、快速、特异、灵敏的特点。

由于中药材的加工和储藏过程极不利于DNA 的保存，采用传统的RFLP标记进行遗传分析十分困难，PCR的发明使分子标记技术取得了突破性进展。PCR技术能对微量或高度降解的DNA 样品进行分析，尤适用干燥药材鉴别。

中药龟板和鳖甲来源复杂，加之资源急剧下降，市场上出现的混乱品种达15种之多。

而其鉴别特征不明显，外观真伪鉴别十分困难。我国南京师范大学王亚明等从保存9年以上的药材龟板和鳖甲中提取出DNA ，并用细胞色素b基因片断的通用引物对L 14724和H 15149(引物间距长约500 bp)，通过PCR扩增到了长约500 bp的DNA 片段，对其成功地进行了DNA 指纹鉴别。

2.3　DNA 序列标记　《日本药局方》收载的当归(Angelica acutiloba)主要是奈良地区栽培的大和当归和北海道栽培的北海当归2种品系，在药材品质上两者存在较大的差异，但外观上极难鉴别。据水上元报道，自当归干燥药材以及当归、三岛柴胡、珊瑚菜(Glehnia littoralis，我国作北沙参用，日本用作滨防风)新鲜材料中分别按常规提取DNA ，采用5S-rRNA 基因片断(间距约300 bp)的通用引物对5S P1和5S P2，通过PCR扩增，结果得到预计的约300 bp片断的PCR产物，并发现药材与对应植物两者的PCR指纹一致。进一步将这些PCR产物用pGEM-T载体进行，然后测序 ，结果表明2个栽培品系间的5S-rRNA 基因片断上第202，207，254号核苷酸序列不同，而商品药材当归的扩增产物(299 bp的基因序列与大和当归品系的完全一致。进一步发现当归特异扩增片断299 bp与珊瑚菜(303 bp)的同源性为87%、而与三岛柴胡(312 bp)的同源性仅48%，而且只有当归的5S-rRNA 基因片断间隔区存在Hind Ⅲ识别位点(第232～237号核苷酸)，采用Hind Ⅲ酶解PCR产物可以在DNA 分子水平鉴别当归与柴胡、北沙参等伞形科药材。因此，5S-rRNA 基因片断序列分析可以用于药材的基原鉴别。

日本富山医科药科大学Fushim等报道，自人参属3种植物人参、西洋参和竹节参(P.japonicus)药材以及对口新鲜材料中分别按常规提取DNA ，采用18S-rRNA 基因片断的通用引物对18S F和18S R，通过PCR扩增，结果得到了约1.8 kb片段的PCR产物。经过DNA 测序 发现3种药材间的18S-rRNA 基因片断上第497、499、501和712号核苷酸序列不同，这表明18S-rRNA 基因片断上500 bp左右位置的核苷酸序列差异作为一种DNA 分子标记可用来鉴别人参及其相关药材。

鸡内金与鸭内金外观十分相似，较难区分。中国科学院昆明动物研究所王建云等人从鸡内金类药材中提取DNA ，采用线粒体DNA 细胞色素b基因片段通用引物对L 14841和H 15149，通过PCR特异扩增，得到一个长度约为300 bp的片段。经测序 ，得到约143个碱基的DNA 序列片断，其中36个碱基的差异可以明确分鸡内金与鸭内金。

但是，常规PCR所需的引物对必须是在已知靶DNA 序列的前提下才能设计、合成，这大大限制了未知序列的DNA 扩增的应用范围。

2.4　RAPD和AP-PCR标记　1990年有人第一次证明用任意顺序的10个碱基的寡核苷酸作单引物，以未知序列的DNA 为模板，通过PCR扩增可获得一组不连续的DNA 片断。故建议将这种随机扩增的多态性DNA 称为RAPD分子标记。几乎同时有人用20个～30个碱基的任意单引物，以未知序列的DNA 为模板，通过PCR扩增，做基因的DNA 指纹分析获得成功，他们称之为任意引物PCR(AP-PCR。

香港中文大学邵鹏柱和毕培曦领导的研究小组在1994年初首次报告对中药材人参和西洋参采用AP-PCR标记进行鉴别。他们采用20个碱基的Gal K，Seq2，24个碱基的M 13 forward，M 13 reverse和27个碱基的TCS backward作引物成功地利用AP-PCR指纹图谱技术鉴定出商品人参和西洋参。1995年分离人参属3种植物人参、西洋参、三七(P.notoginseng)和4种伪品包括桔梗、紫茉莉、栌兰、商陆的DNA ，分别采用10个碱基的OPC-5和OPC-20作引物，用RAPD标记可以明显地区别，说明在DNA 分子水平也能鉴别人参属3个品种和人参及其伪品。

日本东京大学Ozeki等分离人参属3种植物人参、西洋参和竹节参以及两种人参制剂高丽红参袋泡茶和OTANECHAN(日本1种人参组织培养物制成的茶)的DNA ，通过RAPD分析，结果发现人参的新鲜根毛组织和干燥药材产生相同的RAPD指纹图形；人参、竹节参和西洋参之间采用不同的引物产生不同的RAPD指纹图；高丽红参茶中几乎没有DNA 片断的扩增(系其提取物无模板DNA 之故)，但从OTANECHAN中扩增到了与人参愈伤组织相同RAPD指纹的DNA 片断。这表明RAPD标记不仅可以用于人参与其它药材的鉴别，而且可以鉴定某些人参制剂中的药材品种。

山崎真已等报告采用RAPD和RFLP两种分子标记方法分析了4种甘草属植物光果甘草(Glycyrrhiza glabra)、甘草(G.uralensis)、刺甘草(G.echinata)和刺果甘草(G.pallidiflora)的遗传关系。通过OPD-2和OPF-2引物扩增的RAPD指纹图谱以及用Bam HI、Dra I、Eco O109I、Hin fI和Nco I酶解后与水稻rDNA 基因pRR217进行分子杂交的RFLP指纹图谱分析并作亲缘关系树，结果发现富含甘草甜素(glycyrrhizin)的品种光果甘草和甘草之间遗传关系非常相近，这两者与不含甘草甜素或含量极低的刺甘草和刺果甘草的遗传关系则较远，与植物分类学研究相吻合。进一步对4种商品甘草包括新疆甘草、西北甘草、西伯利亚甘草和阿富汗甘草采用RAPD方法作遗传距离估算以进行药材基原鉴别，初步证实阿富汗甘草来源于光果甘草、西伯利亚甘草来源于甘草、新疆甘草和西北甘草来源于胀果甘草。同时认为它们之间遗传距离不完全为零，可能与其他地理环境或存在亚种、变种有关。

日本九州大学Nakai等采用RAPD标记方法对淫羊藿属8种植物进行了DNA 分析，结果发现RAPD指纹图谱较易区别箭叶淫羊藿(Epimedium.sagittatum)和其它7种淫羊藿。

中国中医研究院中药研究所曹晖等采用CTAB微量提取法分离菊科地胆草属2种植物地胆草(Elephantopus scaber)、白花地胆草(E.mollis)和假地胆草属1种植物假地胆草(Pseudo-elephantopus spicatus)以及4种商品苦地胆药材的DNA ，利用18个～24个碱基的6种引物(M 13 forward，M 13 reverse，Gal K，Seq 2，P 4，SH 1133)进行AP-PCR和用10个碱基的OPC-6引物进行RAPD扩增，获得清晰可靠的DNA 指纹图谱，根据这些指纹图谱的差异可鉴别出地胆草及其混淆品白花地胆草和假地胆草。同时进行DNA 指纹图谱的相似度指数值测定计算分析，证实从福建厦门、台湾高雄、香港和澳门获得的商品药材苦地胆、地胆头、土公英、小本灯竖圬的基原为地胆草。

我国南方部分省区有多种菊科不同属的植物如地胆草、一点红Emilia sonchifolia、苦荬菜(Paraixeris denticulata)、毛大丁草(Piloselloides hirsuta)、山莴苣(Pterocypsela indica)、苦苣菜(Sonchus arvensis)以“土公英”之名混作蒲公英(Taraxacum mongolicum)使用。曹晖等利用AP-PCR和RAPD分子标记方法对蒲公英及其6种土公英混淆品进行了DNA 指纹鉴别研究，结果显示它们的DNA 指纹图谱存在明显的差异，利用这种差异可从分子水平上鉴别蒲公英及其混淆品。

成都军区昆明总医院张荣等用RAPD方法对铁线莲属7种生药山棉花(Clematis chrysocoma)、三叶五香血藤(C.fasciculifolia)、小九头狮子草(C.ranunculoides)、小木通(C.armandii)、红叶铁线莲(C.rubifolia)、红钉耙藤(C.brevicaudata)和铁线莲(C.florida)进行了鉴别，结果表明RAPD指纹图谱中种间差异明显而同种不同产地差异不明显。用同样的RAPD分析法对木蓝属8种生药蒙自木蓝(Indigoferae mentzeana)、鸡眼草(I.striata)、苍蝇草(I.hancockii)、山皮条(I.szechuenensis)、小苦参(I.sensitiva)、野青树(I.suffruticosa)、尾叶木蓝(I.caudata)、昆明木蓝(I.mairei)也进行了鉴别研究，结果表明RAPD分析法是一种有效的中药鉴定方法。

日本广岛大学Kohjyouma等对日本野生或栽培的茅苍术及其变种(A.lancea var.simplicifolia)、北苍术、关苍术和白术采用GC和RAPD方法分析它们的挥发油组成和亲缘关系，结果表明苍术酮(atractylon)不仅在关苍术和白术(日本作白术用)中存在，而且在茅苍术及其变种(日本作苍术用)中亦有发现，RAPD谱带证明了茅苍术存在种内变异，这与水上元等人采用RFLP分析的结果完全一致。

蛇类药材如乌梢蛇(Zaocys dhumnades)和金钱白花蛇(Bungarus multicinctus)市场上出现6种混淆品种和伪品，仅靠其外部形态和骨骼、鳞片特征难以鉴别。南京师范大学王义权等成功地利用RAPD方法准确地检出乌梢蛇和金钱白花蛇的混淆品和伪品。

对不同产地(中国、美国、加拿大)西洋参和不同来源(厦门、高雄、香港、澳门)苦地胆由AP-PCR和RAPD产生的同一品种DNA 指纹图谱几乎一致，由此说明PCR方法在中药品种鉴别上的稳定性和重现性。无论是RAPD或AP-PCR本质上都是任意引物的随机扩增，只是引物的碱基长度不同而已。RAPD标记所需样品DNA 的量仅为10 ng，是AP-PCR标记十分之一左右，且RAPD引物已可商品化生产。因此，它可以在不知道特异DNA 序列的情况下检测DNA 的多态性，尤其在目前绝大多动、植物中药材DNA 序列尚不清楚的情况下，在中药品种研究方面RAPD标记比其它分子标记更具有广阔的应用前景。