SWATH技术常见问题与解答
金开瑞生物
Q：SWATH技术的原理是什么？我为什么要做SWATH？
A：SWATH采集模式是一种新型的MS/MS扫描技术，将扫描范围划分为以25Dalton为间隔的一系列区间，通过超高速扫描来获得扫描范围内全部离子的所有碎片信息，是MS/MSALL技术的扩展。
SWATH技术可以用于蛋白质定量或蛋白复合体的鉴定。
SWATH定量方法基于提取Transition峰面积计算出肽段含量，通过肽段含量推理出蛋白质含量。SWATH定量应用到proteome-wide水平就产生了SWATH定量蛋白组，以此方法为基础可以迅速锁定几个样品间的差异蛋白质。
同时，采用SWATH采集模式进行样品中的宿主蛋白分析（HCPs），可以全面、准确定量分析的同时获得MSMS信息，一次进样即可完成任意数量HCPs的定量分析工作，并在30分钟的LC梯度内，完成ppm级HCPs的含量测定。
SWATH和TAP技术联合使用确定蛋白复合体的成分是SWATH技术最常用的应用之一，金开瑞生物高精度质谱平台，开发了一套从实验到生物信息分析的AP-SWATH流程，采用TAP技术将目标靶蛋白的相互作用蛋白特异性富集，然后结合具有高灵敏度、高准确度、高通量等特点的，能够高特异性的准确富集到靶蛋白的特异性相互作用蛋白，实现复合蛋白质的准确鉴定。
Q：SWATH定量蛋白质组做完实验后，能拿到什么结果呢？可以直接用来发文章么?
A：SWATH 技术的应用在2013年发表了两篇NM，近期也有不少文章发表。金开瑞目前的SWATH定量蛋白质组的实验流程和结果都是受到业内顶级杂志JPR和MCP公认的，可以直接用于文章的发表。
客户不仅可以拿到SWATH定量蛋白质组中的差异蛋白、蛋白的GO和KEGG归类信息、COG归类、不同样本的差异蛋白的聚类分析、差异蛋白的互作蛋白信息等，还可以提供客户指定的分析内容，提供个性化的服务要求，比如转录组和蛋白质组的关联分析。
Q：关于“样品重复”，技术重复和上机重复有什么区别？发表的文章一般要求几次重复呢？
A：一般的文章会要求做2~3次实验重复，仅作1次实验是有风险的，因为如果是实验过程出现问题，缺乏结果的评估，往往说服力不够，对文章发表可能构成影响。
技术重复一般和上机重复非常类似，即上质谱的重复，即测试仪器的稳定性，判断系统误差等问题。
这一说法主要和质谱仪器的发展进程相关，早期的仪器不是很稳定，同一个样本上机3次，结果差异较大，当前的上机重复仍然在一些JPR和MCP文章中可见，即沿用了早期的习惯。而应用型的文章中，上机重复或技术重复一般没有硬性规定，可以不做，如果做了当然最好，editor就不会再此处找你的问题。
Q：SWATH、iTRAQ和SILAC等相比，我更应该选择哪一种定量方法呢？
A： 目前主流的定量蛋白质组方法有5种，分别是iTRAQ、SILAC、MRM(MRMHR)、label-free和SWATH 。其中最流行的是iTRAQ定量蛋白质组方法，该方法不依赖样本，可以做任意样本的总蛋白质的差异定量，而且定量准确，这个层次上label-free虽然也可以做任意样本，但是定量准确度难以保障。
SILAC是仅仅适合细胞层次的蛋白质组定量，组织的定量需要摸索或者前人已经摸索的模式，中途测试新组织难度较大，极易失败，细胞层次的SILAC培养费用高昂，不适合做商业化。
MRM和SWATH都是目标蛋白质组相关的定量模式，但是SWATH可以完成数千种蛋白的定量，准确度极高，通量远高于MRM，对于亚细胞结构、细菌、真菌、细胞分泌物等样本，SWATH效果非常好。
SWATH本身对物种没有偏向性，也是目标蛋白定量的一种，定量结果准确，可以和MRM媲美，发文章更具有说服力，但是一次能定量只能达到2000多个蛋白。
Q：物种没有测序，可以做SWATH么？
A：因为当前大量的物种已经测序，预测了相应的基因，未测序的物种可以通过近缘物种的基因序列作为数据库进行蛋白质组的研究。因此，一般来说，未测序物种可以考虑近缘物种的基因组序列作为数据库，可以做蛋白质组。
Q：SWATH技术的优势和缺陷是什么？
A：SWATH技术的优势在于灵敏度高，它继承了MRM的数据采集模式，结合高分辨率的Triple-TOF5600 plus质谱系统，具有与MRM相当的灵敏度；且重复样品间的定量相关性可达到0.99以上；定量准确度几乎与MRM技术相当；定量范围可跨越4个数量级；定量的效果非常好。但是一次能定量只能达到2000多个蛋白。
Q：SWATH技术适用对象有哪些？采用SWATH技术对样品有什么要求？
A：SWATH技术适合于绝对定量以及蛋白复合体的鉴定，即研究蛋白质在生理条件下的相互作用，针对亚细胞结构、细菌、真菌、细胞分泌物等样本，SWATH定量的效果非常好。
采用SWATH技术，要求样本物种具有基因组序列、ESTs序列或蛋白质参考序列，非常适合于检测细菌等复杂度较低的样品。
Q：SWATHTM方法与目前广泛接受的MRM技术相比有什么优势？
A：SWATHTM采集方法在定量蛋白质组分析方面是非常好的技术，选择SWATH或MRM取决于选择哪一款三重四极杆/QTRAP质谱。为了比较SWATH采集方法与MRM方法的效率，AB SCIEX在最高端的QTRAP 6500进行MRM分析，然后与TripleTOF®的SWATH数据采集结果进行比对。
通过SWATHTM采集方法，可以在一次进样中大规模地对多肽进行定量分析，定量重现性与MRM方法相当。
在QTRAP 6500平台上，进行scheduled MRM的离子对个数比SWATH方法显著减少。但是由于QTRAP 6500的灵敏度和MRM方法的特异性，可以对样品中低丰度的多肽进行定量分析。最重要的是，因为使用相同的离子源和离子碰撞技术，TripleTOF平台的SWATHTM采集方法与QTRAP平台的MRM方法可以无缝链接，显著减少方法开发的时间。
Q：对于质谱来说，什么是影响SWATHTM采集数据好坏的关键因素？
A：像SWATH技术这样的非数据依赖采集模式，需要对覆盖所有肽段的质量范围进行步进式扫描，每一步都要采集所有化合物的MSMS数据。MSMS高分辨率是一个关键参数，它可以在复杂体系中特异性提取靶向化合物的碎片。
更重要的参数是需要高速采集MSMS数据。研究发现，更窄的分离窗口产生的数据特异性更高，因此需要更多的步长覆盖完整的扫描范围，更快的MSMS采集速度来保持最佳的循环时间。这就意味着TripleTOF系统是进行SWATH采集技术的唯一平台：因为高分辨MSMS和高采集速度同时实现；因为可以采用更小的分离窗口。
Q：进行SWATHTM数据处理时，建立离子数据库的最佳方法是什么？
A：现在用于SWATH靶向数据处理的工作流程非常简单，只需要多肽母离子m/z，主要碎片的m/z和相对丰度，以及保留时间。目前建立离子数据库主要使用两种策略：IDA采集数据蛋白鉴定或来源于外部数据库。
在第一种方法中，通过信息依赖采集方法(IDA)对样品进行数据采集，蛋白通过ProteinPilotTM软件或其它的搜素引擎进行鉴定，鉴定到的多肽即为用于SWATH数据处理的离子数据库。
选择1D LCMS 或者2D LCMS技术路线取决于我们研究对象数据库的复杂度。借助生物信息学方法，还可以对来自于外部数据库的MSMS数据进行靶向蛋白分析，同时创建离子数据库，此时需要进行保留时间校正。
Q：通过SWATHTM方法采集数据时，进行保留时间校正的最佳策略是什么？
A：通过SWATHTM软件进行数据处理时，需要确定一个合理的窄的保留时间窗口，以避免选择错误的色谱峰。现在有两种策略用于校正实际观察到的保留时间和数据库中的保留时间的差异。通过在样品中增加多肽标准品，用于数据库构建和SWATH数据采集，或者使用样品中存在的某些已知的中等/高丰度的多肽作为参考物对保留时间进行校正。
