RT-PCR PROTOCOL
互联网
RT-PCR PROTOCOL
材料与方法…………………………………………………………
1 ．材料 ………………………………………………………
1.1 供试用组织( 细胞)…………………………………
1.2 主要仪器设备………………………………………
1.3 主要试剂……………………………………………
1.4 工具酶及试剂盒……………………………………
2. 实验方法……………………………………………………
2.1 总RNA 提取 …………………………………………
2.2 RT-PCR………………………………………………
2.3 琼脂糖凝胶电泳……………………………………
材料与方法
1. 材料
1.1 供试用动物组织/ 细胞
1.2 主要仪器设备
1.5ml 离心管、0.2ml PCR 管、高速离心机、5~10ul 加样器、2~20ul 加样器、20~200ul 加样器、TAKARA PCR 仪、551 可见光透射仪
1.3 主要试剂
RNAlocker 、RNAout 、RNAsaver 、氯仿、异丙醇、75% 乙醇、琼脂糖、SYBRGREEN I 染料。
1.4 工具酶及试剂盒
TaKaRa One Step RNA PCR Kit
2. 方法
2.1 RNA 提取和纯化
估算RNAout 、组织或细胞的用量。取组织或细胞后，将剩余的组织或细胞放入RNAlocker 中保存以备下次使用。将组织或细胞匀浆后，加入1.5ml 离心管。加入0.2 倍RNAOUT 体积的氯仿，振荡混匀30 秒。室温离心15000g 3 分钟。将上清液转移到另一干净离心管中。在上清液中加入等体积的异丙醇, 振荡器上振荡混均30 秒。室温离心15000g 5 分钟，RNA 沉淀将在离心底的侧面形成，小心吸弃上清液。清洗：在含RNA 沉淀的离心管中加入1 毫升75% 乙醇, 振荡器上振荡混均30 秒。室温离心15000g,1 分钟。小心吸弃上清液。重复清洗步骤。将离心管倒置于滤纸上以干燥RNA 。加DEPC 水使RNA 沉淀溶解，剩余的RNA 沉淀使用RNAsaver 溶解以备下次使用。
2.2 RT-PCR
2.2.1 取 TaKaRa One Step RNA PCR Kit ，按下列组成配制 RT-PCR 反应液。
10 ×One Step RNA PCR Buffer 5 μl
MgCl2 (<chmetcnv>25mM</chmetcnv>) 10 μl
dNTP Mixture(<chmetcnv>10mM</chmetcnv>) 5 μl
Rnase Inhibitor(40U/ μl) 1 μl
AMV RTase XL(5U/ μl) 1 μl
AMV-Optimized Taq (5U/ul) 1μl
上游特异性引物（20μM ） 1μl
下游特异性引物（20μM ） 1μl
Positive Control RNA 或实验样品（≤1μg total RNA ）_____________1μl
Rnase Free dH2 O 24μl
Total 50μl/Sample
~undefined 当目的RNA 的表达数量较少时，可加至25 μl 。同时在反应体系中相应地应叫少Rnase Free dH2 O 的量。
2.2.2 按以下条件进行 RT-PCR 反应。
<chmetcnv>50 ℃</chmetcnv>30min RT 反应
<chmetcnv>94 ℃</chmetcnv>2min RTase 失活
<chmetcnv>94 ℃</chmetcnv>30sec
<chmetcnv>37 ℃</chmetcnv>~<chmetcnv>65℃</chmetcnv>30sec
<chmetcnv>72 ℃</chmetcnv>1~10min PCR 反应25~30 循环
● 当 RNA 为 Positive Control RNA 时，反应条件如下。
<chmetcnv>50 ℃</chmetcnv>15min RT 反应
<chmetcnv>94 ℃</chmetcnv>2min RTase 失活
<chmetcnv>94 ℃</chmetcnv>30sec
<chmetcnv>60 ℃</chmetcnv>30sec
<chmetcnv>72 ℃</chmetcnv>1.5min 25~30 循环
<chsdate>2.2.3</chsdate>反应结束后，取 PCR 反应液 (5 ~ 10 l) 进行琼脂糖凝胶电泳，确认 RT-PCR 反应产物。
如果此 PCR 产物需用于以后实验，应将 PCR 产物冷冻保存。
Control 反应时扩增片段大小为 462 bp 。
2.3 RT-PCR 产物确认
电泳后，将SYBRGREEN I 染色的凝胶用可见光透射仪观察结果，确认RT-PCR 产物。
