RT-PCR PROTOCOL

RT-PCR PROTOCOL

材料与方法…………………………………………………………

1 ．材料 ………………………………………………………

1.1 供试用组织( 细胞)…………………………………

1.2 主要仪器设备………………………………………

1.3 主要试剂……………………………………………

1.4 工具酶及试剂盒……………………………………

2. 实验方法……………………………………………………

2.1 总RNA 提取 …………………………………………

2.2 RT-PCR………………………………………………

2.3 琼脂糖凝胶电泳……………………………………

材料与方法

1. 材料

1.1 供试用动物组织/ 细胞

1.2 主要仪器设备

1.5ml 离心管、0.2ml PCR 管、高速离心机、5~10ul 加样器、2~20ul 加样器、20~200ul 加样器、TAKARA PCR 仪、551 可见光透射仪

1.3 主要试剂

RNAlocker 、RNAout 、RNAsaver 、氯仿、异丙醇、75% 乙醇、琼脂糖、SYBRGREEN I 染料。

1.4 工具酶及试剂盒

TaKaRa One Step RNA PCR Kit

2. 方法

2.1 RNA 提取和纯化

估算RNAout 、组织或细胞的用量。取组织或细胞后，将剩余的组织或细胞放入RNAlocker 中保存以备下次使用。将组织或细胞匀浆后，加入1.5ml 离心管。加入0.2 倍RNAOUT 体积的氯仿，振荡混匀30 秒。室温离心15000g 3 分钟。将上清液转移到另一干净离心管中。在上清液中加入等体积的异丙醇, 振荡器上振荡混均30 秒。室温离心15000g 5 分钟，RNA 沉淀将在离心底的侧面形成，小心吸弃上清液。清洗：在含RNA 沉淀的离心管中加入1 毫升75% 乙醇, 振荡器上振荡混均30 秒。室温离心15000g,1 分钟。小心吸弃上清液。重复清洗步骤。将离心管倒置于滤纸上以干燥RNA 。加DEPC 水使RNA 沉淀溶解，剩余的RNA 沉淀使用RNAsaver 溶解以备下次使用。

2.2 RT-PCR

2.2.1 取 TaKaRa One Step RNA PCR Kit ，按下列组成配制 RT-PCR 反应液。

10 ×One Step RNA PCR Buffer 5 μl

MgCl2 (25mM) 10 μl

dNTP Mixture(10mM) 5 μl

Rnase Inhibitor(40U/ μl) 1 μl

AMV RTase XL(5U/ μl) 1 μl

AMV-Optimized Taq (5U/ul) 1μl

上游特异性引物（20μM ） 1μl

下游特异性引物（20μM ） 1μl

Positive Control RNA 或实验样品（≤1μg total RNA ）_____________1μl

Rnase Free dH2 O 24μl

Total 50μl/Sample

~undefined 当目的RNA 的表达数量较少时，可加至25 μl 。同时在反应体系中相应地应叫少Rnase Free dH2 O 的量。

2.2.2 按以下条件进行 RT-PCR 反应。

50 ℃30min RT 反应

94 ℃2min RTase 失活

94 ℃30sec

37 ℃~65℃30sec

72 ℃1~10min PCR 反应25~30 循环

● 当 RNA 为 Positive Control RNA 时，反应条件如下。

50 ℃15min RT 反应

94 ℃2min RTase 失活

94 ℃30sec

60 ℃30sec

72 ℃1.5min 25~30 循环

2.2.3反应结束后，取 PCR 反应液 (5 ~ 10  l) 进行琼脂糖凝胶电泳，确认 RT-PCR 反应产物。

如果此 PCR 产物需用于以后实验，应将 PCR 产物冷冻保存。

Control 反应时扩增片段大小为 462 bp 。

2.3 RT-PCR 产物确认

电泳后，将SYBRGREEN I 染色的凝胶用可见光透射仪观察结果，确认RT-PCR 产物。