福林法测定酸性蛋白酶活力

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1.1原理

福林试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色反应(钼蓝和钨蓝的混合物)。由于蛋白质分子 中有含酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等)，它使蛋白质及其水解产物呈上述反应，利用这个原理可以测定蛋白酶活力的强弱。

以酪蛋白为作用底物，在一定pH值和温度下，同酶液反应，经一段时间后加入三氯乙酸，终止酶的反应，并使残余的酪蛋白质沉淀，同水解产物分开。经过滤后取过滤液(含蛋白质水解产物的三氯乙酸溶液)，用Na2C03碱化，再加入福林试剂使之发色。

蓝色反应的强弱与过滤波中蛋白水解产物的量成正比例，而水解产物的量又同酶活力成正比。因此，根据蓝色反应的强弱可以计算出蛋白酶的活力。

1.2操作方法

1.2.1 试剂

1.2.1.l福林试剂

于2000ml磨口回流装置内加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g，钼酸钠(NaMoO4·2H2O)25g。水700ml，85%的磷酸50ml，浓盐酸100ml，文火回流10h，加入硫酸锂(Li2SO4)150g，蒸馏水50ml，混匀取去冷凝器，加入几滴液体溴，再蒸沸15min，以驱逐残溴及除去颜色，溶液应呈黄色。若溶液有绿色，需再加数滴液溴，再蒸沸除去，冷却后定容至1000ml，过滤，置于棕色瓶中保存，此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释。

1.2.1.2 0.4mol/l的TCA溶液

称取三氯乙酸65.4g，加水定容至1000ml。

1.2.1.3 0.8mol/l的碳酸钠溶液

称取无水碳酸钠84.8g，加水溶解，定容至1000ml。

1.2.1.4 pH值为3.6的醋酸缓冲液

称取NaAc·3H20 16g与268ml浓度为6mol/l的醋酸溶液混合，稀释定容至1000ml。

1.2.1.5 2%酪蛋白溶液

称取干酪索20g，加入0.lmol/l的氢氧化钠20ml，在水浴中加热溶解，然后用pH值为3.6的醋酸缓冲液定容至1000ml。该试剂配制后应及时使用，或放入冰箱内保存。

1.2.1.6 100μg/ml酪氨酸溶液

精确称取在105℃供箱中烘干至值恒重的酪氨酸0.1g，逐步加入0.lmol/l的盐酸，使之溶解，加蒸馏水定容至1000ml。该试剂配制后也应及时使用，或放入冰箱内保存。

1.2.2 绘制标准曲线

配制浓度分别为(单位：μg/ml)：0、20、40、60、80、100的酪氨酸溶液，各取lml(做4个平行样)，加入不同的试管中，再各加入已稀释的福林试剂lml和0.4mol/l的碳酸钠5ml，摇匀，置于水浴锅中，40℃保温发色20min。

然后在721型分光光度计 上进行比色测定(波长660nm，以浓度为0μg/ml的酪氨酸反应液做空白对照)。

1.2.3 样品酶活的测定

称取酶粉5g，充分碾细，加蒸馏水1000ml，在 4O℃水中搅拌3Omin，充分溶出酶蛋白，然后过滤，滤液用0.1mol/lpH值为3.6的醋酸缓冲液稀释到一定倍数。取稀释液1ml(做平行样4个)，40℃水浴预热2min，再各加入经同样预热的酪蛋白1ml，精确保温10min。

然后立即加入 0.4mol/l三氯醋酸2ml，终止反应。继续置水浴中保温20min，使残余蛋白质沉淀，然后离心分离或过滤。取滤液lml，再加入0.8mol/l碳酸钠溶液5ml和已稀释的福林试剂1ml，摇匀保温发色20min后，进行比色测定。对照标准曲线，计算酪氨酸的释放量。

l.2.4 酶活计算

蛋白酶活力=A×4×N/10

式中：A——对照标准曲线得出的酪氨酸释放量;

4--4ml反应液取出1ml;

N--酶粉的稀释倍数;

10——反应时间10min。

酸性蛋白酶酶活定义：在40℃，每分钟水解干酪素产生1μg酪氨酸定义为一个蛋白酶活力单位.