TTC法测定根系活力

植物根系的活力是植物生长的重要生理指标之一。植物的根系是肥水的主要吸收器官，又是物质同化、转化和合成的器官，因此，根系的生长情况和活动直接影响植物个体的生长情况、营养水平和产量水平。本实验的目的是掌握 TCC 法测定植物根系活力的原理和方法。

TCC 法测定植物根系活力的基本原理是 TCC 是氯化三苯基四氮唑（2，3，5-tripheyl tetrazolium chliride）的英文缩写，又名“红四氮唑”，是标准的氧化还原色素（还原前的电位为 80 mV），溶于水后呈无色的溶液。具有生活力的根在呼吸代谢过程中产生的还原物质 NADP（P）+ H⁺ 等，能将无色的 TTC 还原成红色的 TTF（三苯基甲臆）。其反应如下：

生成的 TTF 不溶于水，但溶于某些有机溶剂（如甲醇和乙酸乙酯等），而且所生成的红色在空气中比较稳定（不会在空气中被自动氧化）。因此，TTC 是酶试验中被广泛应用的氢受体。TTC 还原量能表示脱氢酶活性，其颜色深浅与根系活力成正相关，并在波长 485 nm 处有最高吸收峰。因此，可用分光光度法定量测定 TTC 颜色的深浅，进而判断根系活力。根系活力的大小以其还原四氮唑的能力来表示。

器材：分光光度计、分析天平、恒温箱、具塞刻度试管、三角瓶、量筒、移液管、烧杯、镊子、单面刀片、研钵、漏斗等。

试剂：

① 植物的根系

② 0.4% TTC 溶液：称取 TTC 0.4 g，加入 95% 乙醇少许使其溶解，然后用蒸馏水稀释至 100 mL。

注意事项：配好的溶液贮于棕色瓶中避光保存，若变红时不能使用，需重新配制。

③ 1.0% 对氨基苯磺酸：称取 1 g 对氨基苯磺酸溶于 100 mL 30% 的醋酸溶液中。

④ 亚硝酸钠溶液：称取 10 mg 亚硝酸钠溶于 100 mL 蒸馏水中。

⑤ 0.1 mol·L^-1 pH7.0 磷酸缓冲液

⑥ 0.2 mol·L^-1 pH7.0 磷酸缓冲液

⑦ 乙酸乙酯；

⑧ 保险粉（Na₂S₂O₄）；

⑨ 1 mol·L^-1 H₂SO₄ 溶液。

TCC 法测定植物根系活力的基本过程可分为如下几步：

（一）显色

选取长度与粗度基本一致的根，切下根系，称重，装入 50 mL 烧杯内，分别加入 0.4% TTC 溶液和 0.1 mol·L^-1 pH7.0 磷酸盐缓冲液各 5 mL，充分混合，并使根尖切段完全浸入上述溶液中，置 37 ℃ 保温箱 1 h，使根尖切段显色（红色）。
注意事项：TTC 溶液贮于棕色瓶中，避光贮存并放入冰箱中，最好现配现用。

（二）测定

保温时间一到，立即加入 1 mol·L^-1 H₂SO₄ 溶液 2 mL 以终止反应。取出根段，用滤纸吸干外附水分，置研钵中，加乙酸乙酯 3~4 mL 研磨（不加石英砂）。将提取的红色 TTF 小心倒入刻度试管，残渣用乙酸乙酯冲洗 2~3 次，直至洗液不带红色为止。全部洗液合并于试管中，最后用乙酸乙酯定容至 20 mL；摇匀后，以乙酸乙酯为对照，于 485 nm 下比色， 记录 OD 值。

（三）标准曲线绘制

取 0.4% TTC 溶液 0.4 mL，加乙酸乙酯 19.6 mL 和少量保险粉，充分摇动，所生成的红色 TTF 溶液作为已知母液。取干洁试管 6 支（1~6 号），依次加入上述母液 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，再依次加入乙酸乙酯 20.0、19.0、18.0、17.0、16.0、15.0 mL，每管含 TTF 为 0、40、80、120、160、200 μg。混匀后于 485 nm 下比色，记录 OD 值，绘制标准曲线。

（四）结果计算

式中：W一根尖重，g；
C一从标准曲线上查得的 TTF，μg；
M一提取液稀释倍数；
t一显色时间，h。