流式细胞术应用 | 鉴别 NLRP3 敲除小鼠的循环髓系细胞群

实验简介

表面标志物通常用于区分循环血液中的群体。使用表面标志物 Ly6C（造血细胞）、Ly6 G（粒细胞 / 嗜中性粒细胞）和 CD115（MCSF 受体），我们能够描述来自 C57BL/6J 野生型对照小鼠和 NLRP3 敲除样品的新鲜血液中的 循环细胞群。

由于 NLRP3 可影响炎症小体形成，所以我们假设单核细胞与粒细胞比例会有差异。此外，我们有兴趣观察对照组与基因敲除组之间 CD115（MCSF 受体）的表达。

CytoFLEX 流式细胞仪对于探寻血液循环中的不同亚群具有优良的性能。

专有的波分复用（WDM）检测模块使 用固态、高效率、低噪声光纤阵列光电二极管检测器（FAPD），为稀有细胞的检测提供卓越的分辨率，获得更好的检测效果及更加精确的数据。该方案描述了具有红色和蓝色激光器配置的 CytoFLEX 流式细胞仪的分析使用。

材料与方法

▶ 试剂

▶ 样品处理

1. 通过心脏穿刺抽吸 100～600 μL 小鼠血液；

2. 将新鲜血液转移至含 40 μL 0.5M EDTA 的 1.5 mL 试管中；

3. 用 1X 低渗裂解溶液裂解红细胞 5 分钟；

4. 试管在室温下以 400 x G 力离心分离 10 分钟；

5. 去除上层清液，将其余部分重新悬浮于 500 μL MACS 缓冲液（Miltenyi）或等效物中；

6. 细胞在 4° C 下以 400 x G 力离心分离 10 分钟；

7. 将分离的细胞重新悬浮在 100 μL 含有 5％ 正常小鼠血清和 5％ 正常大鼠血清的 MACS 缓冲液中；

8. 加入抗体和染色剂。在冰上孵育 30 分钟；

抗体	数量
Ly6C – PE	0.5 μL
Ly6 G – FITC	1.0 μL
CD115 – PE	2.5 μL

9. 在 4° C 下以 400 x G 力离心分离 10 分钟；

10. 吸出上清液；

11. 重新悬浮在 600 μL MACS 缓冲液中；

12. 采用 CytoFLEX 流式细胞仪进行分析。

▶ 利用 CytoFLEX 进行数据采集

1. 创建新的试验；

2. 绘制 FSC/SSC、PE/FITC 和 PE/APC 的散点图；

3. 导入 FITC、PE 和 APC 先前确定的补偿设置；

4. 创建针对单核细胞和粒细胞的门；

5. 以高速检测样品；

6. 自动调节缩放比例；

7. 至少捕获 50,000 个事件；

8. 保存数据。

结论

通过使用表面标志物 Ly6C 和 Ly6 G，我们能够观察到我们的野生型对照和 NLRP3 敲除样品之间循环单核细胞和粒细胞群的动态变化。此外，在野生型对照中观察到的 CD115（MCSF 受体）和 Ly6C 的双阳性群在 NLRP3 敲除样品中不存在。

该观察结果以前在其他仪器上未检测到。CytoFLEX 流式细胞仪操作简单，对于探寻血液循环中细胞亚群的差异是一种灵敏和可靠方法

数据

图 A 和 D 显示门控策略。绘图 B 和 E 描绘了野生型与 NLRP3 敲除小鼠中单核细胞和粒细胞百分比的比较。 绘图 C 和 F 证明了双阳性群的存在 / 不存在。

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