原位杂交组织化学对照实验

为证明原位杂交实验操作的准确性和实验结果的可靠性，必须设置一系列对照实验。对照实验的设置应根据核酸探针和靶核酸的种类以及现有的可能条件选定。一般应在下述几种对照实验中选择3～4种，以证实杂交结果的可信性。

1．Southern或Northern印迹反应 原位杂交能在组织细胞原位显示待测核酸(DNA或RNA)的存在。为了进一步证实原位杂交所显示的核酸是否存在于被检组织内，可从被检组织中提取DNA或总RNA，然后分别用Southern或Northern印迹法进行检测。

一般情况下，Southern或Northern印迹反应结果与原位杂交结果一致，两者互相支持。但是，当阳性细胞在被检的组织中所占比例很小时，原位杂交结果可能为阳性，而印迹反应则由于靶核酸的含量太低而呈阴性结果。

2．免疫组织化学 如果能获得靶基因产物抗体，可结合免疫组织化学方法，从蛋白质(或多肽)水平在相邻切片或同一切片中证明蛋白质(或多肽)和相应的mRNA共存于同一细胞中。

1．已知阳性组织和已知阴性组织对照 用探针在已知含靶核酸序列的阳性组织和已知不含靶核酸序列的阴性组织标本上进行原位杂交，应分别得到阳性结果和阴性结果。如果已知阳性组织出现阴性结果，则应对探针的制备及原位杂交的各个步骤进行检查。相反，如已知阴性组织出现阳性结果，则提示存在非特异性杂交信号。

2．用有意义链RNA探针做原位杂交 因为无意义链RNA的碱基序列与靶mRNA碱基序列互补，故检测组织细胞中的mRNA时常用无意义链RNA探针(反义RNA探针)进行原位杂交。而有意义链RNA探针碱基序列则与靶mRNA的序列相同，因此，用有意义链RNA探针进行原位杂交应得到阴性结果，这一阴性对照实验是证明探针特异性的很好方法。

3．吸收实验 将标记探针先同与之互补的DNA或RNA杂交，然后再进行原位杂交，结果应为阴性。此实验类似于免疫组织化学的吸收实验。

1．空白实验 在进行原位杂交时，将杂交液中除去标记探针，结果应为阴性。这是一项简便而有意义的阴性对照。

2．杂交前用核酸酶预处理标本 根据靶核酸是DNA或RNA，对被检测的标本用DNA酶或RNA酶进行预处理以消化被检核酸，然后再进行原位杂交。与未经DNA酶或RNA酶预处理的标本相比，如果杂交信号明显减弱，则证明标记探针与未经酶预处理标本中的DNA或RNA之间有杂交体形成。

通常以核酸酶预处理标本并不能使杂交信号完全消失，要完全消化靶DNA或RNA则需要对酶的浓度和消化时间等因素反复摸索后才能实现。在做此项对照实验时应注意在核酸酶处理后，需把加在标本上的酶清除干净，以免残留的酶破坏探针而导致错误结论。

(四)检测系统对照

1．放射自显影检测系统对照 放射性核素自显影对照包括空白片的阳性对照和阴性对照。阳性对照是将浸渍乳胶的空白片在光线下曝光后显影，阳性结果证明乳胶及显影过程工作正常。

阴性对照是将空白片浸乳胶后不经曝光便与原位杂交标本一起进行显影，结果应为阴性。如果阴性对照片上有较多银粒，则说明乳胶有放射性污染，应丢弃并换用新乳胶。

2．非放射性原位杂交检测系统对照 绝大部分的非放射性原位杂交反应是以免疫组织化学方法进行显示的，在对照实验中应包括免疫组织化学的一系列阳性对照和阴性对照