植物组织培养知识概要

植物组织培养（Plant Tissue Culture）：是指通过无菌操作分离植物体的一部分（外植体explant），接种到培养基上，在人工控制的条件下（包括营养、激素、温度、光照、湿度）进行培养，使其产生完整植株的过程。

（主要有原生质体（Protoplast），悬浮细胞，组织（愈伤组织Callus、茎尖分生组织），器官（胚，花药，子房，根和茎）的培养。其中最常见的是愈伤组织培养。）

愈伤组织（Callus）：原指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组培中则指人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。

植物细胞全能性（Cellular totipotency）：任何具有完整细胞核的植物细胞，都拥有形成一个完整植珠所必须的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。（Haberlandt, 1902）

微（快）繁步骤（micropropagation）：

母株（完整）→外植体（母株的一小部分，种子亦可）→接种到培养基上→长芽（继代增殖）→长根（试管外生根亦可）→练苗，驯化→完整植株

组培发展简史-----细胞学说：Schleiden和Schwann。

1、探索：20世纪初，Haberlandt提出“细胞全能性” （1902）；1904年，Hanning培养萝卜和辣根菜的胚成功；Laibach（1925,1929）亚麻种间杂种胚培养成功，证明胚培养在植物远缘杂交上可利用；1922年，Robiins（美）和Kotte（德）离体根尖培养成功。

2、奠基：Gautheret，White和Nobecourt，组培奠基人。White和Gautheret发现了 B族维生素和生长素；Skoog（1944）和Skoog和崔 （1951）等发现腺嘌呤和生长素的比例控制芽和根的形成，Overbeek等（1941）首次将椰子汁（CM）作为添加剂，Steward等在胡萝卜组培也使用CM；

1952年，Morel和Martin首次证实通过茎尖离体培养可获无病毒植株；1953-1954年，Muir单倍体培养获得成功；1955年，Miller分离出激动素（KT）；1957年，Skoog和Miller提出植物激素控制器官形成的概念；1958年，Steward首次证实Haberlandt的细胞全能性设想；

Wickson和Thimann指出CTK打破腋芽休眠；Murashige发展快繁技术；1958-1959年，Reinert和Steward胡萝卜愈伤组培中形成体细胞胚。

3、迅速发展：1971年，Takebe首次由烟草原生质体获得再生植株；1972年，Carlson获得烟草的第一个体细胞杂种；1964年，Guha和Maheshwari由毛曼佗罗离体花药培养胚；1960年，Morel提出离体无性繁殖兰花。……

组培意义：

1、基础理论研究（试验体系的准确性和可重复性，广泛用于细胞、组织的代谢生理及其它生化等方面的研究（如分化问题））。

2、应用研究（无性繁殖系快速繁殖的生产、试管苗的商品化、遗传育种、种质保存、克服远缘杂交、种质资源创新、获得转基因植株）。

组培应用前景：

1、作物育种上的应用（花药和花粉培养、胚胎培养、细胞融合、基因工程、培养细胞突变体、种质保存）。

2、作物脱毒和快繁上的应用（马铃薯，兰花）。

3、在植物有用产物生产上的应用。

4、在遗传、生理、生化和病理研究上的应用。

植物激素调控：auxin/CTK >1(促进生根) ；=1(愈伤组织) ；<1(促进发芽)

脱分化（dedifferentiation）：在组织培养中，不分裂的静止细胞，放在一定的培养基上后，细胞重新进入分裂状态。一个成熟的细胞转变为分生状态的过程叫脱分化。

再分化（redifferentiation）：一个成熟的植物细胞经历了脱分化后，能再分化而形成完整植株的过程。

再分化途径：

1、器官发生方式（是指在外植体或愈伤组织的不同部位分别独立形成茎、芽和根，它们为单极性结构，各有维管束与外植体或愈伤组织相连，但在不定芽和不定根之间没有共同的维管束将两者连在一起）。

2、胚胎发生方式（外植体直接或通过愈伤组织或悬浮培养产生胚状体）。

胚状体（embryoid）：是指在组织培养中起源于一个非合子细胞，经过胚胎发生和胚胎发育过程形成的具有双极性的胚状结构。

其特点有：

1、不同于合子胚，因为它不是两性细胞融合产生。

2、不同于孤雌/雄胚，因为它不是无融合生殖的产物。

3、不同于器官发生方式形成的茎芽和根，因为它经历了与合子胚相似的发育过程且成熟的胚状体是双极性结构。

器官发生途径：1、茎尖或茎段培养产生腋芽。2、直接不定芽发生：器官的小块组织在培养基上培养直接诱导产生不定芽。3、间接不定芽发生：器官的小块组织在培养基上培养后先去分化形成愈伤组织，再经分化诱导产生不定芽或不定根。

胚胎发生方式：1、直接胚胎发生（从培养物中的器官组织，细胞或原生质体直接分化成胚，中间不经过愈伤组织）。2、间接胚胎发生（外植体先愈伤化，然后由愈伤组织细胞分化成熟）。

球型胚（global embryo）→心型胚（heart-stage embryo）→鱼雷型胚（torpedo-stage embryo）→子叶型胚（cytoledon-stage embryo）

人工种子：是指利用细胞的全能性将离体培养所产生的体细胞或具有发育成完整植株能力的分生组织（胚状体，茎和茎段）包裹在一层含有营养物质并具有保护功能的外膜内形成在适宜条件下能够发育成完整植株的小颗粒。结构包括人工种皮、胚状体（分生组织）、人工胚乳。

植物组织培养应用步骤：1、获得无菌外植体，建立起无菌培养体系。2、进行增殖，不断产生不定芽或胚状体。3、生根培养。4、试管苗移栽。

外植体选择的原则：1、必须含有活细胞。2、幼嫩组织所含活跃分裂的细胞比例高。3、母珠必须健康并且无任何腐烂或生病的迹象。4、母珠必须活跃生长并且不会立即进入休眠。

外植体的确定选择：1、茎尖（园艺植物组织培养中应用最多，繁殖率高，不易发生遗传变异，但取材有限）；2、茎段（采用嫩茎的切段促进腋芽萌发，取材容易）；3、叶（幼嫩叶片组织通过愈伤组织或不定芽分化产生植株，取材容易，操作方便，但易发生变异）；4、花球和花蕾；5、种子、根、块根、块茎、花瓣等。

消毒的原则：消毒剂与外植体应接触足够长的时间以除去外植体表面的微生物，但应尽量减少对外植体细胞的破坏。

消毒方法：冲洗植物材料除去泥土等大的颗粒→浸入70-75％乙醇，有利于植物表面的浸湿→用5-20％NaClO溶液（加1 滴表面活性剂）表面消毒5-10min→用无菌水冲洗至少3遍→与消毒剂接触过的切面在转移到无菌培养基前应切去，因为消毒剂会杀死外露的细胞从而影响营养吸收→切取外植体，通常为10mm的茎段和直径10mm的叶片部分（太大激素作用减弱，太小则不易成活）。

消毒注意事项：1、表面消毒剂对植物组织是有害的，应正确选择消毒剂的浓度和处理时间，以减少组织的死亡。2、在表面消毒后，必须用无菌水漂洗材料3次以上以除去残留杀菌剂，但若用酒精消毒，则不必漂洗。3、与消毒剂接触过的切面在转移到无菌基质前需将其切除，因为消毒剂会阻碍植物细胞对基质中营养物质的吸收。4、若外植体污染严重则应先用流水漂洗1小时以上或先种子培养得到无菌种苗，然后用其各个部分建立组织培养。5、HgCl₂效果最好，但对人的危害最大，用后要用水冲洗至少5次。

茎尖培养：切取茎的先端部分或茎的分生组织部分进行无菌培养。

步骤：无菌培养的建立→芽的诱导→生根培养→试管苗的移栽（遗传变异）

注意点：试管苗移栽过程中，由异养→自养，恒温→温差，无菌→有菌，光弱→光强，湿度高→湿度低，应该保持苗的水分平衡（加塑料薄膜和使用喷雾机），选择适当的基质，注意光、温的条件。

安祖花：叶片→诱导愈伤组织→诱导芽→诱导根      生根
                   ↓              ↑
                增殖→切根→芽的增殖→再培养→壮苗→生根之前

不定胚的诱导：组织片→含有2,4-D的培养基上→产生不定胚→去除2,4-D的培养基上→球型胚→心型胚→鱼雷型胚→植物体。

不定芽的诱导：用BA诱导，在球、心、鱼雷时要去除BA。

胚胎培养的意义：1、对于胚乳发育不良或胚与胚乳间不亲和的材料进行离体胚培养，有助于远缘杂交获得成功。2、为研究胚在各个发育时期的营养需要提供了一个很好的机会。3、能对整个胚及其各部分的再生潜力进行研究。

胚胎培养中的两个重要问题：1、胚剥离的方法：剥离的最佳时间是授粉后13-15天。2、培养基的成分：找到合适的培养基，在胚培养中加入蔗糖（能源、保持适当渗透压）。

花药培养方法：
取材地点：大田和温室
取材：大多采用单核期的花粉培养，因诱导产生愈伤组织或胚状体的频率较高。
花粉时期的确定：常采用醋酸洋红-碘化钾染色，再压片镜检。实际操作中常根据花蕾长度、大小与花粉年龄的相关性确定。
预处理：低温、高温或交叉处理。
培养基：有MS，Nitsch，Miller，B5和N6。低浓度的生长素和细胞分裂素相结合，高浓度的蔗糖对花粉的诱导生长有一定作用。培养基中加入活性炭对提高诱导频率也有一定效果。
消毒、接种和培养：花药→在烧杯中研碎（有溶剂）→过滤→浓度梯度离心→收集中间层→离心
单倍体的鉴定和加倍处理：单倍体用2％秋水仙素处理24小时，愈伤组织细胞自然加倍。

花粉花药培养的意义：1、在单倍体细胞中只有一个染色体组，表现型和基因型一致，一旦发生突变，无论是显性还是隐性，在当代就可表现出来，因此单倍体是体细胞遗传研究和突变育种的理想材料。2、在品种间杂交育种过程中，通过F1代花药培养得到单倍体后，经染色体加倍立即成为纯合二倍体，从杂交到获得不分离的杂种后代单株只需要2个世代和常规育种相比，显著缩短了育种年限。

花药培养步骤（用改良的NLN培养基）：
F1代花药→形成小孢子→分离小孢子→形成愈伤组织→形成胚→单倍体植株→纯合二倍体
               ↓
              形成胚→单倍体植株→染色体加倍形成纯合二倍体

原生质分离：酶（纤维素酶，离析酶）
步骤：叶片表面消毒→去除表皮→叶碎片漂浮在含有酶和渗透压稳定剂的溶液中→培育→原生质体沉到培养皿底部→除去酶溶液→将原生质体移入CPW清洗→离心→清洗基质两次→重悬浮于培养基→除去小的个体，用血球计计数→调整到合适的密度重悬浮于培养基。

原生质体的培养：
培养基：MS＋NAA 2.0ppm＋BA 0.5ppm＋3％蔗糖＋9％甘露醇
注意：1、原生质体分离后，非常脆弱，需要渗透压保护剂的保护直到细胞壁形成。2、针对不同的研究对象，培养基中生长素和细胞分裂素的水平要做适当调整。
影响原生质体培养的因素：营养需求（NH4＋不能过多），渗压剂，培养密度（105/mL）， 贮藏条件（通常在黑暗处）。
培养方法：液体基质培养法，半液体基质培养法，固体基质培养法，看护培养。

固体培养的步骤：原生质体移入培养基→1体积含原生质体的培养基与1体积含琼脂糖（40℃）的培养基混和→倒转培养皿在25℃下培养→原生质体重新产生细胞壁并分裂成细胞团→细胞团于琼脂糖基质中传代培养，培养基中应减少渗压剂以利于愈伤组织的形成→诱导分化成植物的根，茎。

原生质体分离培养的意义：1、除去了细胞壁为植物细胞之间的融合扫平了障碍，同时叶为制造新杂种开辟了道路。2、原生质体可摄入外源DNA，细胞器、细菌或病毒颗粒，这些特性与植物全能性相结合为高等植物的遗传饰变打下基础。3、获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料。

原生质的融合概念：从同一个种或不同种分离得到的原生质体在适当的条件下融合得到细胞核物质和细胞质物质的混和。

体细胞杂交：完全不经过有性过程，只通过体细胞融合制造杂种的方法称为体细胞杂交。

原生质体融合方法：自发融合，诱发融合（NaNO3处理，高PH-高浓度钙离子处理，PEG处理，电融合）

PEG法：
取材（1、从绿色叶片上分离得到的原生质体。2、来源于同种或不同种的细胞悬浮培养物上分离出的无色原生质体）－这样异核体和母体就可分辨开→分别取在含有13％甘露醇的CPW上悬浮培养的原生质体（密度2×105）4mL，混和在100g的转速下离心 10min，将原生质体放入0.5％基质→加入30％（w/v）PEG 2mL，使原生质体的外膜不稳定，放置10min→每隔5min加入原生质体培养基稀释PEG以促进原生质体融合。每次稀释后轻微摇动原生质体就会重悬浮→混和物在100g下离心10min，离心后在不含PEG的培养基中清洗→离心，在相同的培养基上重悬浮。

PEG法的缺点：有毒，融合率低-----不超过1％。
      对称融合：父母均未处理，对后代贡献一样。
      不对称融合：父母本在后代中贡献不同，射线处理，化学处理IOA（不影响核的分裂而影响细胞质分裂）

胞质杂种：利用原生质体融合技术，使两种不同来源的核外遗传成分（细胞器）与一个特定的核基因组结合在一起，就形成胞质杂种。
      体细胞杂种和胞质杂种的鉴定方法：形态学，细胞学，分子遗传学。

园艺植物脱毒：
      热处理脱毒：

原理：在高于正常温度下，植物组织中的很多病毒可被部分或完全钝化，而很少伤害甚至不伤害寄主组织。

方法：热水处理（对休眠芽效果好），热空气处理（对活跃生长的茎尖效果好）

热空气处理方法：空气温度35-40℃，持续时间：随处理对象不同而变化，几分钟-几星期。

注意点：不能一下子放入高温中，要逐步加温使之适应。并保持湿度和光照。

局限性：1、并不是所有的病毒都对热处理敏感。2、对等径和线状的病毒及类菌质体引起的病害是有效的。3、热处理后只有一小部分植株能够存活。

茎尖分生组织：指茎的最幼龄叶原基上方的一部分，最大直径约100μm，最大长度为250μm。
      茎尖：由顶端分生组织及其下方的1-3个叶原基一起构成的。

茎尖培养脱毒：

原理：病毒在植物体内的分布是不均匀的，在受感染的植物中顶端分生组织通常不含或仅含低浓度的病毒，其它的植物组织离茎尖的距离越远则病毒含量越高。

影响茎尖培养脱毒效果的因素：培养基，外植体大小（脱毒效果跟外植体大小呈负相关，茎尖的成活率与茎尖大小呈正相关），贮存条件（光照培养优于暗培养），外植体的生理状态（活跃生长的芽，顶芽的效果比腋芽好，切割芽的时间）。

通过愈伤组织培养脱毒：

原理：在由受感染的组织形成的愈伤组织中，并非所有的细胞都均匀一致地带有该种病原体。

产生原因：1、病毒的复制速度跟不上细胞的增殖速度2、有些细胞通过突变获得了抗病毒的特征。

脱毒植物的鉴定：外观判断法，指示植物法（接种鉴定法），抗血清鉴定法，电镜检查法，分光光度法，酶联血清免疫吸附反应鉴定法。

指示植物法：利用病毒在其它植物上产生的枯斑作为鉴别病毒的标准。

指示植物：专门选用以产生局部病斑的寄主称为指示植物。

无毒原种的保存：种在温室或防虫罩内灭过菌的土壤中，隔离区内，通过组织培养繁殖。

组培常见英汉对照
abortion（败育）adenine（腺嘌呤）agar （琼脂）anther（花粉）apical（顶端的）aseptic(无菌的) auxin（生长素）axillary bud （腋芽）callus，calli（愈伤组织）cellular totipotency（细胞全能性） cellulase（纤维素酶）cellulose（纤维素）centrifuge（离心）chloroplast（叶绿体） chromosome doubling（染色体加倍）colony（细胞团，菌落）cybrid（cytoplasmic hybrid,胞质杂种） cytokinin（细胞分裂素） cytoplasm（细胞质）degeneration （败育）dedifferentiation （脱分化）redifferentiation（再分化）dicotyledonous（双子叶的）dihaploid（二单倍体）diploid（二倍体）dissect（剥离）dormancy（休眠）eliminate （除去） embryo（胚胎）embryoid（胚状体）embryogenesis（胚胎发生方式）epidermis（表皮，上表皮）excise（切除） explant （外植体）filter paper（滤纸） gelose（琼脂糖）genetype（基因型）germplasm（种质） global embryo （球型胚） haploid（单倍体）heterokaryon（异核体）homozygous（纯合的）hormone （激素）interspecific（种间的）intraspecific（种内的）in vitro（体外）in vivo（活体）kinetin（激动素）macerozyme（离析酶）male sterile（雄性不育）medium（培养基）membrane（膜）meristem（分生组织）meristem culture（茎尖培养）micropropagation（微繁）microspore（小孢子）monocotyledon/moncots（单子叶植物） nod culture （茎段培养）organelle（细胞器）organgenesis（器官发生方式）osmotic（渗透的）pith（髓）plantlet（小植株，苗）pollen culture（花粉培养）pollinate（授粉）protocorm（PLB）原球茎protoplast fusion（原生质体融合）rapid propagation（快繁）regeneration（再生）self-incompatibility （自交不亲和） shoot tip（茎尖） sodium hypochlorite（NaClO）somatic embryo（体细胞胚）somatic hybridization（体细胞杂交）somatic hybrid（体细胞杂种）stem（茎）stem tip culture（茎尖培养）sterilant（消毒剂）sterile distilled water（蒸馏水）sterilization（消毒）stock plant （母株）subculture (继代)  sucrose（蔗糖） terminal bud（顶芽）transfer （转移）virus eradication（脱毒）   

常用缩略语
ABA（脱落酸）      CM（椰子汁）      CPW（细胞-原生质体清洗液）
DMSO（二甲基亚砜）  IAA（吲哚乙酸）    IBA（吲哚丁酸）
KT（激动素）       NAA（萘乙酸）    PEG（聚乙二醇）
LH（液氮）        CH（水解酪蛋白）   GA3（赤霉素）