核酸提取、PCR、荧光定量PCR常见问题解答

第一部分 核酸DNA和RNA提取常见问题分析

1. RNAfixer的工作原理?

浸入组织，抑制RNase的活性。运输方便，是非液氮类的一种样品储存液。

2. 对于内源RNase丰富的组织和样品，如何消除RNase?

可以在提取时候多加裂解液，比如4：1等。

3. TRIpure and RNApure区别?

胍盐类的裂解液一样，RNApure附加有离心柱，和漂洗液，是Kit。TRIpure只是裂解液。

4. 凝血的gDNA和RNA的提取与新鲜血的提取不同?

需加一个分离柱(separate column)分开凝血。

5. MicroRNA提取和定量?

过2次离心柱，得到200 bp一下的小RNA。可以测定OD定量。

6. 血清，血浆，血液RNA提取的区别?以及Viral RNA提取的方法?

液体类样品RNA提取用TRIpure LS。一般血清、血浆是无细胞样品，含游离的RNA，量比较少，建议加Carrier RNA在提取时候。病毒RNA提取最好加Carrier RNA在提取时候，BioTeke有专门的病毒RNA提取试剂盒。

7. 通用植物RNA提取常见问题：蛋白质污染?

DNA污染-DNaseI消化(Kit does not provide it, please get it from other companies.)

8. 真菌RNA提取

可用RNApure 或者通用植物RNA提取Kit。

9. DNA cleanup from gel and PCR, 区别?

胶回收含有一个溶胶液。多功能胶回收可以用于胶回收和PCR产物回收。

10. 土壤DNA提取优点?

无需要机械破碎样品和过柱的纯化方式，减少DNA的锻炼和得率，达到实验目的。

第二部分PCR/RT-PCR常见问题解答

1. 二次PCR无目标产物，电泳孔道亮?

Template稀释和重新设计引物

2. microRNA的反转录问题?

microRNA反转录和普通的mRNA的反转录不一样。现在常见的microRNA反转录引物有2种，一个是step-loop结构;另外一种是3末端加polyA后，再用oligo(dT)逆转录。BioTeke有microRNA提取和2-step real-time PCR Kit。

3. cDNA的合成(RT)电泳，以及cDNA第二链的合成问题?

2-5uLcDNA产物电泳有模糊条带出现。第二链合成也有专门的试剂盒。BioTeke现在没有此类产品。

4. Power Mix扩增不成功因素?

产品或者引物或者目的基因的不表达。

5. RT-PCR没有扩增产物?

可能是引物，模版，产品等。

第三部分 Real-time qPCR 常见问题分析

1. 做标准曲线时候，可否用2个不同体系浓度的稀释分别对于内参和目的基因?

建议最好用同样稀释倍数做曲线，因为模板浓度会影响扩增效率。

2. 熔解曲线中，Tm不出现在80度左右?

扩增片段100 bp左右的，一般应该出现在80度左右。如果低于此温度出现，可能是模板降解。

3. 扩增曲线没有Ct值，仅仅一条斜线?什么原因?

模板浓度过低或者模板降解。

4. 如果内参和目标基因表达量差别比较大，也就是目的基因的表达量少，Ctcon=15，Cttarget=38，可否应用?

可以用于数据分析。因为表达量低，从而用过高模板进行扩增，从而同内标的模板不同，反而会增大数据统计的误差。

5. 引物浓度可否是50nM，是否太低?

如果扩增曲线和熔解曲线比较好，这个浓度当然可以。如果更低，扩增结果好的情况下，同样可以运用。一句话，所有的模板、引物等浓度尽量不要用高的，会影响扩增效率。

6. miRNA多个扩增时候，如果一个的扩增效果比较，其它熔解曲线不止一个峰，如何解决?

Primer对于miRNA是专一的。所以重新设计引物是不可取的。那么只能是提高Tm或者更换mastermix等。反应体系会影响反应产物的。

7. 相对定量方法，如果用Ct值比较，是各个样品平均后在2delt Ct还是分别2 delt Ct在平均比较好?

相对定量的方法各有优缺点，主要取决于实验的目的和材料的准备。如果是材料群体个体差异不大，这2种方法基本没有很大的区别;如果是个体差异比较大，建议用双标准曲线做。就是分别做内参和目的基因的标准曲线，分别带入Ct值计算。

8. 熔解程序可否不加?

如果是扩增效果好，特异扩增，可以不加熔解程序;但建议做好加上。

9. 扩增反应体系5uL，扩增效率低，什么原因?

反应体系小，各种因素的影响比较大，比如引物浓度、模板浓度及其金属离子等会影响扩增效率的。

10. 如何减少非特异性扩增的干扰?

设计一对好引物，提高primer的退火温度，以及设定吸光温度。