蛋白质的定量测定方法：考马斯亮蓝染料结合比色法

【实验目的】

掌握用考马斯亮蓝染料结合比色法测定蛋白质含量的原理和操作方法。

【实验原理】

考马斯亮蓝G-250是一种染料，在游离状态下呈红色，最大吸收峰在465nm。当它与蛋白质结合后变成深蓝色，最大吸收峰变为595nm。蛋白质含量在1-1000μg范围内，蛋白质-染料复合物在595nm处的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用比色法测定。

蛋白质-染料复合物具有很高的吸光值，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度，最低检出量为1μg蛋白。染料与蛋白质结合迅速，大约为2分钟，结合物的颜色在1小时内稳定。所以本法操作简便，快速，灵敏度高，稳定性好，是一种测定蛋白质含量的常用方法。

【实验材料】

1. 实验器材

721型分光光度计；试管；移液管；容量瓶。

2. 实验 试剂

(1)标准蛋白质溶液：称取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水中并定容至100ml，制成100μg/ml的溶液。

(2)考马斯亮蓝G-250 试剂 ：称取 100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml 95％乙醇中，加入85% (m/v) 的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000ml。此溶液可在常温下放置一个月。

(3)样品溶液：配制约50μg/ml的牛血清白蛋白溶液作为样品。

【实验方法】

1. 绘制标准曲线

取6支干燥洁净的大 试管 ，编号，按下表加入试剂。

管号	1	2	3	4	5	6
标准蛋白溶液（ml） 蒸馏水（ml） 考马斯亮蓝G-250试剂（ml） 蛋白质含量（μg）	0.0 1.0 5 0	0.2 0.8 5 20	0.4 0.6 5 40	0.6 0.4 5 60	0.8 0.2 5 80	1.0 0.0 5 100

上述试剂加完后，混匀，室温静置2min，以第1管为对照，在595nm处比色，读取各管吸光值，以牛血清白蛋白含量为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线

2. 样品测定

准确吸取1.0ml样品溶液于一支干燥洁净的 试管 中，加入考马斯亮蓝G-250试剂5ml，摇匀，室温静置2min， 以标准曲线1号管为对照，在595nm处比色，记录吸光值。

【实验结果】