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哺乳动物细胞的RNAi技术策略

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目前RNAi技术已经进入了生物科学研究的许多领域,成为了一种主要的生物学研究工具,发展得相当迅速,并受到了此次诺贝尔奖评审委员会的青睐,获得2006年诺贝尔奖医学/生理奖。

然而这一才历经十个年头的技术依然对于许多研究人员来说还是很陌生的,以下是有关 i技术在哺乳动物细胞中应用的具体设计策略,主要来自于《遗传》杂志2005年“ 干涉(i)技术应用于哺乳动物细胞的研究策略”,希望能给从事或者准备从事 i相关实验的研究人员以帮助。

一、靶si 序列选择

靶si A序列选择是 i实验成败的关键。哺乳动物细胞 i实验中,使用最广泛且最有效的是21bp si 。si 由正义链和反义链组成,两条链3’端均有2个碱基突出,一般为UU或dTdT,其中正义链的前19nt与靶基因序列相同。

1. si 设计的原则

Si 双链设计时,一般在靶m 起始密码下游100―200bp至翻译终止密码上游d0―100bp的范围内搜寻AA序列,并记录每个AA3’端相邻19个核苷酸作为候选si. 靶位点。其中AA(N19)TT是最理想的序列,若靶m 中无此序列,亦可选用NA(N21)或NAR(N17)YNN(R表示嘌呤,Y表示嘧啶),但在合成时,si 的正义链3’端需用dT―dT代替。

TuscRl等建议设计的si 不要针对m 的5’和3’端非编码区,因为这些区域有丰富的调控蛋白结合位点,而UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP(si protein complex,核酸内切酶复合物)结合m ,从而影响si 干扰的效果。最后还应将候选si 序列在GenBank进行BLAST检索,与非同源基因具有3个或3个以上碱基相异的序列方可选用。

2. 高效si 的序列结构特征

除了靶序列位点的选择,siI 序列本身结构特征亦会影响到 i效率。 i实质上可视为一个与蛋白质互作过程,包括si 与RISC结合、RISC的激活以及RISC与靶m 的结合和切割,这种互作效应的存在,往往造成si 链的选择具有偏爱性。Reynolds等通过对2个基因的180条si 序列分析,归纳出以下8个与

si 高效性相关的特征:G/C含量低(30%-52%),正义链3’端具较低稳定性(有利于si 与RISC的结合和解链),无反向重复序列(有利于减小si 的有效作用浓度,提高si 干扰效率),正义链碱基的偏爱性A19(正义链中第19位碱基为A,如下表示类同);A3;U10;无G/C(正义链中第19位碱基不为G或C);无G13。

依此规则,Reynolds等设计的30条si 中有29条是有效的。Kumiko等亦认为si 反义链5’端为A/U(即有义链U/A)19和最后7个碱基中有5个A/U,会有助于 i的高效发挥,且正义链G/C1和序列中无连续9nt以上的GC重复片段与基因沉默效率呈显著相关。

有趣的是,该实验还表明这些规则同样适用于DNA介导的 i(DNA-based i.)实验。此外,Amarzguioui等发现正义链5’与3’端的前3个碱基中A/U含量不对称(3’端含量应高一些)和A6对si 的活性亦影响很大。根据上述结果,可以初步绘制出一个高效si 序列结构的精细与简略示意图。

现已知道si 的反义链决定着靶位点识别,那么在不影响si 作用功效的前提下,是否可以对其正义链碱基作适当更改或修饰呢?Amarzguioui等研究si 不同部位对碱基突变和化学修饰的耐受性,认为si 的5’端相对于3’端具有对突变的较高耐受性。

有学者认为正义链3’突出端的任何碱基修饰对si 作用效果均无明显影响。还有学者认为与反义链互补的正义链3’端发生1―4个碱基的错配反而有助于增强 I的活性。

二、si 制备方法

目前为止较为常用的5种制备si s的方法包括

化学合成

体外转录

长片断ds s经RNase III 类降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)

si 表达载体或者病毒载体在细胞中表达si s

PCR制备的si 表达框在细胞中表达

前面3种方法包括体外制备si s然后经过转染或者电转导入哺乳动物细胞后面两种方法则依赖能够表达si s的DNA载体或者表达框转染到细胞中。每种方法都有自己的优点和缺点。哪种是最好的方法,其实取决于实验目的。这里简单介绍这5种方法,优点和缺点,以及它们最适合的应用。

si 的设计

除了方法3以外,其他的方法都在制备si 前都需要单独设计si 序列。关于怎样设计si 以及si 设计对si 功能的影响,尽管我们不断掌握越来越多有关设计原则的信息。但这仍然不是精确的。通常来说,每个目标序列设计3―4对si s,在后面的实验中选择最有效的那个。网上有提供免费的si 设计工具。

体外制备


1.化学合成

尽管化学合成是最贵的方法,但是却是最方便的――研究人员几乎不需要做什么工作。包括Ambion和Qiagen公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成si 。主要的缺点包括价格高,定制周期长,特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高,为一个基因合成3―4对si s 的成本就更高了,比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。

最适用于:已经找到最有效的si 的情况下,需要大量si 进行研究

不适用于:筛选si 等长时间的研究,主要原因是价格因素

2.体外转录

通过体外转录的方法可以合成si s,这样的成本相对化学合成法而言比较低,是一种性价比高的筛选si s的好方法。更重要的是采用这种方法能够比化学合成法更快的得到si s。以Silencer  si Construction  Kit为例,一旦得到DNA Oligo模版(这个还是需要DNA合成的,不过DNA合成的成本就比较低了),只要24小时就可以,不需要等很久。这个方法的不足之处是实验的规模受到限制,虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的si s,但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比,还是需要占用研究人员相当的时间――毕竟,化学合成只需要定购就可以了。值得一提的是体外转录得到的si s只要较低的浓度就可以达到化学合成si s较高浓度得到的效果(0.5-20 nM vs. 50-100 nM  per transfection)

最适用于:筛选si s,特别是需要制备多种si s,化学合成的价格成为障碍时。

不适用于:实验需要大量的,一个特定的si 。长期研究。

3.用RNase III 消化长片断双链制备si

其他制备si 的方法的缺陷是需要设计和检验多个si 序列以便找到一个有效的si 。而用这种方法――制备一份混合有各种si s “混合鸡尾酒” 就可以避免这个缺陷。这个方法是选择通常是200―1000碱基的靶m 模版,用体外转录的方法制备长片断双链ds ,然后用RNase III (or Dicer) 在体外消化,得到一众si s“混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的ds 后,这个si 混合物就可以直接转染细胞,方法和单一的si 转染一样。由于si 混合物中有许多不同的si s,通常能够保证目的基因被有效地抑制。

ds 消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效si 序列的步骤,为研究人员节省时间和金钱(注意:通常用 se III通常比用Dicer要便宜)。不过这种方法的缺点也很明显,就是有可能引发非特异的基因沉默,特别是同源或者是密切相关的基因。现在多数的研究显示这种情况通常不会造成影响。Ambion公司曾经用它的Silencer  si Cocktail Kit(RNase III)试剂盒成功关闭几个基因,包括c-fos, GAPDH, La,-actin, 和Ku-70。

最适用于:快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型

不适用于:长时间的研究项目,或者是需要一个特定的si 进行研究,特别是基因治疗

体内表达

前面的3种方法主要都是体外制备si s,并且需要专门的转染试剂将si s转到细胞内。而采用si 表达载体和基于PCR的表达框架则属于:从转染到细胞的DNA模版中在体内转录得到si s。这两种方法的优点在于不需要直接操作。

4. si 表达载体

多数的si 表达载体依赖3种聚合酶III 启动子(pol III)中的一种,操纵一段小的发夹si 在哺乳动物细胞中的表达(1�4)。这3类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用 pol III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子,而且它是通过添加一串(3到6个)U来终止转录的。要使用这类载体,需要订购2段编码短发夹序列的DNA单链,退火,克隆到相应载体的pol III 启动子下游。由于涉及到克隆,这个过程需要几天的时间,同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。不过幸好载体容易大量扩增,这个优点足以弥补所有缺陷,特别是当载体在实验中确实有效的时候。

毫无疑问,si 表达载体的优点在于这是众多方法中唯一可以进行长期研究的方法――带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达,持续数星期甚至更久。即使是对转染带有筛选标记质粒的细胞进行瞬时筛选,也有助于富集带质粒的细胞。这也可以帮助解决一些难转染的细胞由于转染效率低造成的问题。

最近多个厂家开始研究逆转录病毒和其他病毒载体用于si 表达,其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究,避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便。

最适用于:已知一个有效的si 序列,需要维持较长时间的基因沉默,或者需要用抗生素筛选能表达si 的细胞。长期研究。

不适用于:筛选si 序列(其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作)


5. si 表达框架

si 表达框架(si expression cassettes,SECs)是一种由PCR得到的si 表达模版,能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。这个方法最早是由Castanotto和其同事(5)采用,包括一个 pol III启动子,一段发夹结构si ,一个 pol III终止位点。和si 表达载体不同的是,SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤,可以直接由PCR得到,不用一天的时间。因此,SECs成为筛选si 的最有效工具,甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和si 的最适搭配!如果在PCR两端添加酶切位点,那么通过SECs筛选出的最有效的si 后,可以直接克隆到载体中构建si 表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达si 和长效抑制的研究。

这个方法的主要缺点是PCR产物很难转染到细胞中。如果有适合的新型转染试剂能提高SEC的转染效率的话,那问题就可以解决了。另外,没有克隆到载体中的PCR片断并不适于大规模制备。

Silencer Express si Expression Cassette Kits提供人源和鼠源的U6启动子或者人源H1启动子元件可供选择,并已经过c-fos基因抑制的检验。

最适用于:筛选si 序列,在克隆到载体前筛选最佳启动子

不适用于:长期抑制研究。(如果克隆到载体后就可以了)

三、si 的转染

将si 、si 表达载体或SECs导入哺乳动物细胞中是诱导 I发生的关键。有许多转染试剂可供选用,最常用的是脂质体转染试剂。某些情况下电穿孔法亦可用,但易导致较高的细胞毒性反应。对于同一细胞系,使用不同的转染试剂或方法,其效率往往会有所不同;而对于不同的细胞系,使用同一种转染试剂或方法,效果亦会不同。因此在实验过程中,有必要尝试多种试剂或方法来确定最优条件。转染效率可通过测定细胞的密度,转染的时间和si 与转染试剂的比例来评价。

四、实验对照设置

实验对照是衡量 i.实验数据可信度的一个重要因素。设立阳性对照目的是通过检测不同浓度的si 转染效率及其最终干扰效果,来确定合适的转染条件和最低有效的SI 浓度。有实验表明RISC复合物具有饱和性,且过多si 会导致细胞毒性和死亡。对于大多数细胞,持家基因(如GAPDH,c-cmyc, β―acion等)是较好的阳性对照,针对这些基因的高效SI 序列已有报道。阴性对照是用来检测 i的特异性。通常作为阴性对照的si 与选中的si 序列有相同碱基组成,但与靶m 无明显同源性。阴性对照的si 序列设计有2种方法,一是将特异性si 的序列打乱,即“零乱”si (scrambled si ),再对其进行BLAST比对,防止与目的靶细胞中的其他基因有同源性;另一种是在特异性si 中引入几个错配碱基。若引入的是一个碱基错配,应需考虑它与突变m (即SNP位点)结合能力,最好在设计si 时就避免SNP区。

五、i效果检测

i效果可从m 和蛋白质两个水平来进行量化。在m 水平上,Northern Blot和实时定量PCR是两种常用方法。值得注意的是在进行实时定量PCR时,cDNA合成要用oligo(dT),而不是随机引物,且预扩增片段最好位于靶m 序列中si 位点的上游。蛋白质水平可以通过Western Blot、荧光免疫检验法、流式细胞分析术和表型分析来检测。 i一般在转染后24小时内发生,其引发基因沉默的程度和持续时间依赖于靶蛋白质的降解率(turnover rate of the protein)、si 在细胞内的寿命以及其逐渐被稀释的程度。

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