稳定的 rAAV 制造细胞的构建技术

稳定的 rAAV 制造细胞的构建技术

材料

试剂

AAV 质粒

pAAV: 在质粒的骨架中克隆了 rAAV 载体的重组质粒

pRC: 含有在其原始操纵子下表达的 AAV 和 c a p 基因但不带病毒反向终端重复序列的质粒

这些质粒的性质将随造出的 A A V 的血清型和所使用 rAAV 载体而不同。
细胞培养基

DMEM (Sigma-Aldrich) 培养基，含 有 1 0 % 胎 牛 血 清（研究级别）、 1 % 青霉素（5 〇 U/ml) 和 链 霉 素（Cambrex， 50um/ml)

G 418 储 存 液（100m g /m l ， m/V )

将 5 gG 418 (Invitrogen) 溶 解 于 50 m l 无菌蒸馏水中，然后将储存液用 0.2 Mm 滤器过滤并存储在一 20°C 。

H e L a (A T C C C C L - 2 ) 或 A 549 (A T C C C C L -1 8 5 ) 细胞

潮霉素 B 储 存 液（l O m g /m l , m/V )

将 I g 潮 霉 素 B (Invitrogen) 溶 解 于 IOOml 无菌蒸镏水中，然 后 将 储存液用〇.2um 滤 器 过滤并存储在一 2 〇°C 。

选择性质粒

pPGK-neo: 该质粒在鼠磷酸甘油酸盐激酶-1 启动子控制下编码新霉素抗性
基因

p S V - h y g r o : 该质粒在病毒 S V 4 0 启动子控制下编码潮霉素抗性基因

任何可表达选择性标记的重组质粒都可以替代这两个质粒。

I X 胰蛋白酶 / E D T A 溶液

将 10X 胰蛋白酶 / E D T A 储 存 液（Sigma-Aldrich) 用 无 菌 0.9 % NaCl 稀 释 ，将溶液存储在-20℃。

野生型腺病毒 5 (A d 5) (A T C C V R -5)

方法

稳定的包装细胞系的构建

1 . 在 转 染 前 24 h ，将 HeLa 或 A 549 细 胞 接 种 于 IOc m 组织培养盘中，密度 为 3 XIO⁶ 个。

每种细胞系的密度不同，必须保证转染前细胞汇合度能达到 5 0 % 〜8 0 % 。

2.用 CaPO4 将 10 ug pRC 和 I.0 ug pPGK- neo共转染细胞。

3.24 h 后 ，胰蛋白酶消化细胞，梯 度 稀 释悬浮细胞（1/5、 1/10、 1/20、 1/40)，然后将每个稀释度的细胞重新接种 IOcm 细 胞 盘（两个拷贝）。培养细胞 20〜24 h。

4 . 吸去细胞培养基并且加人新鲜的含 l m g / m l G 418 的培养基。

5.继续培养细胞 3〜4 周，每 2d 更换一次含 l m g / m l G 418 的培养基。

在 转 染 后 7〜1 4 d 内大量的细胞死亡，转 染 后 3〜4 周单克隆开始出现，在此期间内，保持对 细 胞 的 G418 选择压力是很重要的。

6•从底部观察和标记单个的克隆，然后分离单克隆。胰蛋白酶消化克隆后，使用克隆环或移液器吸头从培养板上刮去单克隆。

7•将单克隆细胞在无 G 418 培养基中培养扩增该克隆，使之铺满两个 IOc m 细胞板。

8•收集一个 I O c m 培养板上的细胞并一 80°C 冻 存（每瓶约 5X 106 个细胞），用另外一个培养板上的细胞制备基因组 D N A 。

筛 选 存 在 和（或）cap D N A 的克隆

9•在病毒感染 24 h 前 ，融化并扩增 PCR 阳性克隆，然后将细胞接种到 6 孔细胞板上的两 个 孔 内（每孔约 5X 10⁵ 个细胞)。

使 用 合适的引物以基因组 D N A 为 模 板 扩 增 r 印 和（或）D N A 来 筛 选 克 隆 ，同时以PRC 质粒为阳性对照。

10.对 于 HeLa 和 A549 细胞，以感染复数为 5 0 的情况下用野生型 Ad5 感染其中的一孔细胞。

调整感染复数使被感染细胞达到 9 0 % , 在被感染细胞孔内能清晰的观察到细胞病变。