CHO细胞的稳定表达

1、pcDNA3.1＋-gD的线性化: pcDNA3.1＋使用说明书推荐了以下几个酶作为线性化酶(BglⅡ MfeⅡ Bst1107Ⅰ Eam1105Ⅰ PvuⅠ ScaⅠ SspⅠ),通过DNAMAN分析gD序列发现其带有MfeⅡ酶切位点。

2、转染前一天,在60mm的dish中接种8×105个细胞,加入5ml培养基(含血清,不含抗生素),37℃,5%CO2培养,至转染时要求细胞40%-80%汇合。

3、通过分光光度计测定pcDNA3.1＋-gD的浓度,用不含血清、抗生素、蛋白质的培养基稀释2.5ug的pcDNA3.1＋-gD至总体积150ul，其最小浓度不低于0.1ug/ul,稀释后应颠倒几次EP管以混匀混合物。

4、向混匀的混合物中加入15ul转染试剂(PolyFect Transfection Reagent  QIAGEN),用加样器吹打5次。

6、在室温下(20-25℃)孵育混合物5-10分钟。

7、在孵育的同时，吸出dish中的培养基，用PBS液洗涤一次，加入3ml的培养基(含血清，不含抗生素)。

8、孵育完成后加入1ml培养基(含血清),用加样器吹打2次，将产物全部加入60mm的dish中，轻轻摇动dish以混匀。

9、37℃,5%CO2培养，在细胞汇合度不超过50%时加入G418进行筛选。

转染时转染两组细胞，组一在转染后细胞汇合度不超过50%时（一般是24小时）加入G418进行筛选；组二在转染后待细胞汇合度达到80%时1/4000、1/1000、1/300分别接种于dish中，48小时后加G418筛选。

10、加入G418后，每3天更换一次含有筛选浓度的G418。当有大量细胞死亡（5-7天）时，可以把G418的浓度减半维持筛选（此时可以加入适应性培养基1：4来改善细胞对培养基的同化作用）。

11、筛选10-14天后，可见有抗性的克隆出现，停药培养，待其逐渐增大后，制备细胞悬液，记数，用培养基稀释细胞到1个/10ul。在96孔板中加入培养基150ul/孔，再加入细胞悬液10ul/孔。待其逐渐增大后转入48孔板中增殖（为了减少实验失误带来的风险建议冻存部分增殖细胞）。

12、细胞大量扩增后，提取总DNA，做PCR检测目的基因是否存在。