机械法分离叶绿体

一、原理

研磨叶片得到的匀浆，经过滤、离心可制备叶绿体。叶绿体的被膜比较脆弱，分离叶绿体应在等渗的缓冲溶液中，0~4℃温度下进行。叶绿体活力会随着离体时间延长而不断下降，因此，分离工作尽可能在短时间内完成。

二、仪器与用具

冰箱；离心机；扭力天平；显微镜；pH计；研钵；量筒；移液管；离心管；脱脂纱布等。分离器皿都须在0℃下预冷。

三、试剂

1. 分离介质

含0.33mol/L 山梨醇，50mmol/L Tris-HCl（或Tricine） pH7.6，5mmol/L MgCl2，10mmol/L NaCl，2mmol/L EDTA，2mmol/L 异抗坏血酸钠。

配法：称60g山梨醇、6.06g Tris、1g MgCl2·6H2O、0.6g NaCl、0.77g EDTA-Na2、0.4g异抗坏血酸钠，溶解后用1mol/L HCl调pH至7.6，定容至1000ml。

2. 悬浮和测定介质Ⅰ

0.66mol/L 山梨醇，2mmol/L MgCl2， 2mmol/L MnCl2，4mmol/L EDTA，10mmol/L焦磷酸钠，100mmol/L Tris-HCl pH7.6。

配法：称60g山梨醇、0.2g MgCl2·6H2O、0.2g MnCl2·4H2O、0.75g EDTANa2、2.23g Na4P2O7·10H2O、6.06g Tris，溶解后用1mol/L HCl调pH至7.6，定容至500ml。

3. 悬浮和测定介质Ⅱ

测定介质Ⅰ稀释1倍。

四、方法

1. 选用生长健壮，最好是连续几个晴天下生长的菠菜叶片，洗净后去除中脉，放入0~4℃冰箱或冰瓶中预冷。

2. 分离介质30~50ml，置于研钵中，并在冰箱中预冷至现薄冰。

3. 取冷却的菠菜叶片10~20g，撕碎后放入研钵，用手工快速研磨0.30~1min，注意不要用力过猛，也不必研磨过细，以叶片磨成小块时即可，研磨后将匀浆用两层新纱布过滤。

4. 将滤液装入预冷过的二个离心管，经天平平衡后，用离心机以1000r/min离心2min。

5. 倾去上层液，沉淀即为叶绿体。随后每管加2ml悬浮和测定介质Ⅱ，并用吸管冲散沉淀。叶绿体悬浮液合并后放冰瓶中备用。

6. 用滴管吸取少量叶绿体，加少量悬浮和测定介质Ⅱ稀释，置显微镜（400~600倍）下，观察叶绿体的形态。

上述是机械法从叶片中分离叶绿体，此外也可从原生质体中分离高活性的叶绿体，具体方法可参照《生物生产力和光合作用测定技术》（科学出版社，1986）一书。