WB实战指南（六）：孵育条件优化

那么如何通过改变抗体稀释液的配方，寻求抗体孵育的最佳条件呢？

首先要认清，抗体稀释液没有一个绝对通用的配方；一种抗体一个脾气。

其次，抗体稀释液的配方要兼顾与特异性抗体竞争抗原的强度，以及对其他区域的封闭强度两方面的平衡。

目前，抗体稀释液中可以充当封闭蛋白的主要有milk，BSA和gelatin，似乎很少的样子 。。。可是，你有没有考虑过“复方”？--这下配方无限多了吧。

1. 采用milk，BSA和gelatin的单方。3% milk，5% BSA，<=0.4%的gelatin，并根据实际情况改变（若出现白板，请降低封闭剂浓度。；黑板多加）。gelatin大家可能比较陌生，不过如果你翻翻抗体公司卖给你的原装抗体里面液体的配方，你会发现很多抗体溶液里都有它。

2.很多情况下单方的浓度很高了，背景问题仍不能解决。那么请尝试两两或者三种不同比例混合。不过有些细节还是要自己摸索的，比如gelatin＋BSA时，gelatin浓度不能无限提高（会完全竞争掉抗原抗体特异性结合，导致白板），BSA的浓度较随意。

3.抗体稀释液可用低盐浓度的TBST，也可用高盐浓度的缓冲液（NaCl 0.5M）以降低背景；但是切记，有的抗体对盐浓度敏感，包括构象和溶解度，因此需要尝试。

如果以上策略仍然无法解决高背景，可将稀释好的一抗先跟平时实验剪切下来的membrane的边角料（新的）放在一起孵育个把小时再用。如果还不行，彻底无解，结论抗体太差；请更换别的公司或者抗别的区段的同种抗体。

这三种封闭蛋白的差异：

milk和gelatin封闭效果不错且价格便宜，但milk容易发霉变质，且国产milk脱脂不充分亦增加背景、拮抗抗原抗体结合（拮抗与抗原结合尤其突出；更不知道三聚氰胺会不会影响抗原抗体结合或者ECL！？）；BSA封闭效果不佳，且价格较昂贵。

个人推荐gelatin，gelatin主要成分是骨胶原，蛋白很大，但可以通过加热打断成小蛋白，从而实现封闭各种分子量大小的蛋白。通常，我会将gelatin加到TBST中后直接灭菌，灭菌过程中，不溶的gelatin会逐渐溶解；由于gelatin可以灭菌（milk不可以），所以同样条件下，gelatin的存放时间明显长于milk。

实际上，抗体可以反复用很久（通常一般的抗体常规稀释比，可以连续用一个月以上；

对于老手用过2、3次的旧抗体更prefer，因此背景降到很低而效价正是最高的时候），通常抗体最后失效的原因不是因为使用次数过多，而是染菌；比较旧的抗体都会有很多的沉淀在底部，更长时间还会有异味。

稀释的一抗靠添加NaN3并于4度保存延长使用时间；二抗不能加NaN3，但放在-20度反复冻融延长使用寿命（抗体并非绝对不可以冻融；只是高浓度的原始管抗体的冻融对效价会有较大影响）。

抗体稀释液（一抗、二抗稀释液也可同也可不同）和封闭液可以相同，可以不同，因为抗体稀释液可以采用复方的，所以即使混合了少许，不会对抗体的使用产生较大的影响。不过封闭液用milk时，gelatin稀释的一抗混入少许milk会影响其使用寿命。

由于以上诸多可变因素，实在无法总结出一种万金油式的抗体稀释液（只能是多数通用），因此对待具体问题时，请具体对待（多花点心思摸索吧）。

感谢丁香园论坛铁杆站友 jacqueslm2001