真菌染色——六胺银法

六胺银染色又称（Periodic-acid silver methenamine）PASM 染色。标本经高碘酸氧化后，使真菌和其他机会性生物的细胞壁内的粘多糖暴露出醛基，醛基将六胺银还原为黑色的金属银。硫代硫酸钠对已显色的银盐起固定作用，并除去未反应的银离子。

用高碘酸与组织发生氧化，使组织的基底膜或真菌内的粘多糖暴露醛基，醛基与六胺银发生作用，将其还原成黑色的金属银，再利用硫代硫酸钠除去未反应的银离子。

主要用于组织基底膜和真菌（主要应用于新型隐球菌、毛霉菌、曲霉菌、组织胞浆菌、马尔尼菲青霉菌、放线菌等）的染色。

① 5% 硼砂水溶液：硼砂 5 克，溶解于 100 毫升的蒸馏水中

② 5% 硝酸银水溶液：硝酸银 5 克，溶解于 100 毫升的蒸馏水中

③ 3% 乌洛托品水溶液：乌洛托品 3 克，溶解于 100 毫升的蒸馏水中

④ 六胺银贮备液：3% 乌洛托品水溶液倒入 5% 的硝酸银液中，产生白色沉淀，摇荡变清亮，4 ℃ 避光保存，可保存约 6 个月。

⑤ 应用液：取贮备液 25 毫升，回至室温，加 5% 硼砂水溶液 5 毫升，现用现配

⑥ 5% 铬酸水溶液：铬酸 （chromic acid）5 克，蒸馏水 100 毫升

⑦ 1% 亚硫酸氢钠水溶液： 亚硫酸氢钠（Sodium bisulfite）1 克，蒸水 100 毫升

⑧ 0.05% 淡绿染液：淡绿 0.1 克，蒸馏水 200 毫升，醋酸 0.1 毫升

⑨ 0.1% 氯化金水溶液：氯化金 0.1 克，溶解于 100 毫升的蒸馏水中

⑩ 3% 硫代硫酸钠水溶液：硫代硫酸钠 3 克，溶解于 100 毫升的蒸馏水中

1、切片常规脱蜡至水洗。

2、然后将切片放入 5% 铬酸水溶液 1小 时，自来水冲洗 5 分钟。

3、随后将切片放入 1% 亚硫酸氢钠30分钟，自来水冲洗 3 分钟，蒸馏水充分洗涤。

4、六胺银应用液首先预热至 60 °C，然后将切片放入配制好的预热的六胺银工作液中 1 小时，切片呈淡黄色即取出经水洗后显微镜观察有否有菌体出现。

如有淡棕色菌体出现，应每隔 5~10 min 观察一次以控制菌体着色深浅，直至显色理想。随后蒸馏水洗 5~6 次。

5、再将切片放入 0.1% 氯化金水溶液调色 4 分钟，蒸馏水洗 1~2 分钟。

6、随后将切片放入 3% 硫代硫酸钠水溶液 5 分钟。

7、自来水洗 1 分钟，蒸馏水洗 1 分钟。

8、淡绿复染 20 秒，流水冲洗 20~60 秒。

9、95% 酒精和无水精脱水，二甲苯透明，树胶封片。

10、染色结果：真菌黑色，背景浅绿色。

1、挑取样本制成涂片，涂片时必须注意细心操作，涂片薄而均匀。制备的涂片应自然干燥，若采取加热固定，固定温度不宜过高，以玻片背面接触手背不烫为准，否则可能使标本的形态改变影响观察结果。

2、氯化金调色时，一定要在显微镜下观察。

3、实验中所用玻璃器皿，应预先用硫酸洗液浸泡并用蒸馏水冲洗干净，烤干。