【共享】20个测序常见的问题

20个测序常见的问题

1．为什么需要新鲜的菌液？

首先，新鲜的菌液易于培养，可以获得更多的DNA，同时最大限度地保证菌种的纯度。

2．如何提供菌液？

如果您提供新鲜菌液，用封口膜封口以免泄漏；也可以将培养好的4～5ml菌液沉淀下来，倒去上清以方便邮寄。同时邮寄时最好用盒子以免邮寄过程中压破。

3．如何制作穿刺菌？

用灭菌过1.5ml或2ml离心管加入LB琼脂(7g/L)斜面凝固，用接种针挑取分散良好的单菌落穿过琼脂直达管底，不完全盖紧管盖适当温度培养过夜，然后盖紧盖子加封口膜，室温或4度保存。

4． PCR产物直接测序有什么要求？

（1) 扩增产物必须特异性扩增，条带单一。如果扩增产物中存在非特异性扩增产物，一般难以得到好的测序结果；

(2）必须进行胶回收纯化；

(3）DNA纯度在1.6—2.0之间，浓度50ng/ul以上。

5．为什么PCR产物直接测序必须进行Agarose胶纯化？

如果不进行胶纯化而直接用试剂盒回收，经常会导致测序出现双峰甚至乱峰，这主要是非特异性扩增产物或者原来的PCR引物去除不干净所导致。

大多所谓的PCR“纯化试剂盒”实际上只是回收产物而不能起到纯化的作用的。对于非特异性扩增产物肯定无法去除，而且通常他们不能够完全去除所有的PCR引物，这会造成残留的引物在测序反应过程中参与反应而导致乱峰。

6．如何进行PCR产物纯化？

PCR产物首先必须用Agarose胶电泳，将特异扩增的条带切割下，然后纯化。使用凝胶回收试剂盒回收，产物用ddH2O溶解。

7． PCR产物直接测序的好处？

（1) PCR产物直接测序可以反映模板的真实情况；

（2) 省去克隆的实验费用和时间；

（3) PCR产物测序正确的片段进行下一步克隆实验使结果更有保障；

（4) 混合模板进行PCR的产物直接测序可以发现其中的点突变。

8．对用于测序的质粒DNA的要求有哪些？

对测序模板DNA的一般要求：

（1)DNA纯度要求高，1.6—2.0之间，不能有混合模板，也不能含有RNA，染色体DNA，蛋白质等；

（2)溶于ddH2O中，溶液不能含杂质，如盐类，或EDTA等螯合剂，将干扰测序反应正常进行。

9．如何鉴定质粒DNA浓度和纯度？

我们使用水平琼脂糖凝胶电泳，并在胶中加入0.5ug/ml的EB(电泳缓冲液中不必加EB)，加一个已知浓度的标准样品。电泳结束以后在紫外灯下比较亮度，判断浓度和纯度。此方法可以更直接、准确地判断样品中是否含有染色体DNA、RNA等，也可以鉴别抽提的质粒DNA的不同构型。

质粒DNA的3种构型是指在抽提质粒DNA过程中，由于各种原因的影响，使得超螺旋的共价闭合环状结构的质粒(SC)的一条链断裂，变成开环状(OC)分子，如果两条链发生断裂，就变成为线状(L)分子。

这3种分子有不同的迁移率，通常，超螺旋型(SC)迁移速度最快，其次为线状(L)分子，最慢为开环状(OC)分子。

使用紫外分光光度计检测，或者用溴乙锭-标准浓度DNA比较法只能检测抽提到的产物中的浓度，甚至由于抽提的质粒DNA中含有RNA、蛋白质、染色体DNA等因素的干扰，浓度检测的数值也是没有多少意义的。

10．为什么抽提的质粒最好溶解在ddH2O中？

全自动荧光测序由于反应体系小，所以对于模板DNA的质量要求比手工测序高许多。通常的提取质粒的试剂盒会提供一个Elution Buffer给用户洗脱DNA，我们建议用户不要使用。因为其中含有的如EDTA等组分会对测序反应产生干扰，甚至导致测序反应失败。

11．对测序引物的要求有哪些？

对测序引物的一般要求：

(1)特异性与测序模板结合，不能有多于4个碱基以上的错配现象；

(2)不能含有混合碱基；

(3)长度17-25碱碱；

(4)纯度高，最好PAGE纯化；

(5)用ddH2O溶解，不要用TE溶解。

12．为什么测序引物必须特异地与DNA模板结合？

测序引物与待测样品DNA分子只能有一个结合位点是测序成功的前提。如果测序引物在DNA模板分子上有不只一个的结合位点，将造成测序反应过程中引物链在几个结合位点处同时扩增，从而得到链长相同而组成不相同的终止链，测序电泳时收集到重叠峰或乱峰，无法读取序列

13．为什么测序引物3'端以后有30-50碱基无法读到？

全自动荧光测序方法由于使用标记了大荧光染料的ddNTP，一些未反应完的ddNTP底物会连同测序反应产物一并被沉淀，在测序电泳时会干扰测序信号，导致这部分碱基无法读清。

一般的我们会在分析结果时切掉这部分无意义的数据。通常这也是载体的序列。所以选取测序引物时要使引物3'端离开要求测序的起始位置50bp以上比较合适。而对于PCR产物测序就不可避免使得测序引物区域附近无法读到数据。

14.为什么在测序报告上找不到引物序列？

有如下几种情况:

（1）找不到测序所用的引物序列。这是正常的，因为荧光测序方法采用的是荧光标记了的ddNTP，自动测序仪通过检测ddNTP上的荧光来读取序列。由于引物本身是不被标记的，所以在测序结果中也是找不到的。

（2）找不到克隆片段的扩增引物。原因可能是您在构建质粒时所用的酶的酶切位点距离您的测序引物太近，由于荧光染料的干扰在序列开始的部分判读不清。

（3）还有一种可能是您的插入片段的插入方向是反的，这时可以找一下引物的互补序列。

（4）存在单引物扩增，有一条引物的特异性不好，有多个结合位点，导致只有一条引物参与扩增。

15．什么是Primer Walking 测序？

大于片断较大的样品，双向测序如果不能完全拼接，我们还可以为用户按照上一个测序结果在一定的位置左右设计引物继续测序，并将测序结果拼接，即Primer Walking 测序。

16．超过6Kb的DNA片断如何进行测序？

超过6Kb的DNA片断用Shot Gun 进行测序准确并且节省时间， Shot Gun方法如下：

（1）用物理方法打碎DNA；

（2）回收1～1.5Kb的片断；

（3）用核酸酶切平端，连接入载体；

（4）按照一定比例进行测序，保证每一个区段有3倍以上的数据；

（5）编辑所有测序数据；

（6）如果有缺少数据的区域，还需要补充测序。拼接成完整序列。

17.为什么测序结果完全不是所需的序列？

出现这样的情况只有两种可能：

（1）我们给您的测序结果对应的不是您的样品；

（2）您的样品插入部分与您预期的不一致。

这时需要双方将样品进行验证（PCR和酶切鉴定）。

18.样品送测序前已经鉴定过了，有插入片段的，为什么测序结果是一个空质粒？

测序是对样品的最好验证.结果为空载，可能如下：

（1）可能在培养过程中发生插入片段的丢失，由于这种情况的发生无法事先预期到；

（2）提供的克隆是假阳性克隆。

19.为什么到重复序列时（PloyA,T,C,G）后面信号几乎都较乱？

重复序列的测定是目前荧光测序方法的一个局限。测序级的酶遇到连续的重复碱基的时候，对模板的判读就会出现打滑现象，导致后面的序列无法判读。这样的情况，建议反向测序。

20．全自动荧光测序的准确性如何？

我们有两种不同型号的测序仪：ABI377和ABI3730

ABI377测序仪采用配套的Big DYE Terminator cycle sequencing Kit，该测序方法以及安装仪器时用标准样品测试，准确性达到一个反应500碱基中只有1个以下的错误(即错误率小于0.05%)。

如果用户得到一个测序结果的彩图是清晰的，峰型是尖的，尖峰与读取的碱基编码是一致的，那么它的准确性应该是可信的。当然如果是新序列，最好用同方向或反方向再测序一次加以验证。因为两次不同的测序，同一个碱基上的错误概率应该小余0.0025%。同时出错的可能性极小。

ABI3730测序仪也是采用AB公司配套的Big DYE Terminator cycle sequencing Kit，其准确性达到800碱基只有1个一下的错误，并且该测序仪对碱基的判读有一个自身的评判值（Quality Value），根据QV值的大小，也可以帮助我们来判断每一个碱基的准确程度。