【共享】免疫组化固定剂的选择

固定是免疫组化的第一步，很多人都忽视了这一步，认为用福尔马林就行，其实学问也挺大的

用于免疫组织化学的固定剂种类较多，性能各异，在固定半稳定性抗原时，尤其重视固定剂的选择，介绍如下。

　　1．醛类固定剂　　双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联，保存抗原于原位，其特点是对组织穿透性强，收缩性小。有人认为它对IgM、IgA、J链、K链和λ链的标记效果良好，背景清晰，是常用的固定剂。

　　（1）10%钙-福尔马林液（浓甲醛10ml，饱和碳酸钙90ml）。

　　（2）10%中性缓冲福尔马林液（浓甲醋10ml，0.01mol/l pH7.4 PBS 90ml）。

　　（3）4%多聚甲醛磷酸缓冲液pH7.4（多聚甲醛40g,0.1mol/L PBS液pH7.4500ml，两者混

　　合加热至60℃，搅拌并滴加1n NaOH至清晰为止，冷却后加PBS液至总量1000ml）。

　　（4）戊二醛-甲醛液（戊二醛1ml，浓甲醛10ml，蒸馏水加至100ml）。

　　戊二醛是二醛基化合物，交联结合力比甲醛大，Bullock认为交联过强，可出现组织改变和空间遮蔽现象，影响组织的抗原性。但McDonald等认为，该试剂用于PAP法免疫酶标记效果仍满意。

　　（5）甲醛升汞固定液（即B5固定液。浓甲醛10ml，氯化汞6g,醋酸钠1.25g ,蒸馏水90ml）。

　　有人认为此固定液悬液是较理想的固定液，标记IgA、IgM、IgG等抗原效果良好。也有人认为它减弱细胞的抗原性，上皮细胞可产生非特异性荧光，故不宜用于免疫荧光标记。氯化汞是一种强蛋白凝固剂，但对组织穿透性弱，且使组织收缩，故与甲醛混合使用。

　　（6）醋酸-甲醛液（浓甲醛10ml，冰醋酸3ml，生理盐水加至100ml）。

　　Bullock等认为此液固定效果良好，组织可不经消化，胞浆IgA、IgG、IgM、IgD和K、λ、J链标记均呈阳性，且背景染色极淡。如标记IgG用PAP法第一抗体仅为甲醛升汞液的1/10。此液内醋酸既可防止组织收缩，又可暴露胞浆免疫球蛋白抗原决定簇。

　　（7）Bouin’s液。

　　该固定液为组织学、病理学常用固定剂之一，对组织穿透力较强而收缩性较小，比单独醛类固定更适合免疫组化染色。Kayhko认为用于标记B细胞的J链较好，但Bullock则认为它可导致Igg γ重链变性，故必需加大第一抗体的浓度。

　　（8）Zamboni’s液。

　　该固定液可用于电镜免疫细胞化学，对超微结构的保存优于纯甲醛，也适用于光镜免疫细胞化学研究。采用2.5%多聚甲醛和30%饱和苦味酸，更可增加对组织穿透力和固定效果，以保存更多的组织抗原。固定时间6-18h。

　　（9）PLP液（过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液）。

　　该固定剂适用于富含糖类的组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。其机制是过碘酸氧化组织中的糖类形成醛基，通过赖氨酸的双价氧基与醛基结合，从而与糖形成交联。组织抗原大多数是由蛋白质和糖两部分构成，抗原决定簇位于蛋白部分，故该固定液有选择性地使糖类固定，既稳定缺的，又不影响其在组织中的位置（固定剂7-9配制法见附录1）。

　　2．非醛类固定剂 Pe等人比较几种非醛类双功能试剂指出，碳化二亚胺、二甲基乙酰胺、二甲基辛酰亚胺、和对苯醌等均适用于多肽类激素的组织固定，单独使用时，边缘固定效应重，但与戊二醛或多聚甲醛混合使用，效果明显改善。

　　（1）碳化二亚胺（1-ethyl-3(3-dimethyl-aminopropyl)cardodiimi-HCI）液：2g溶于100ml0.01mol/L,pH7.4PBS中。此液宜用于标记多肽类激素的组织，对标记IgA、IgG效果不佳。

　　（2）碳二亚胺-戊二醛液（ECD-G液）：配制法见附录一。

　　ECD-[1-ethyl-3(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimide Hydrochloride],即乙基-二甲基氨基丙基碳亚胺盐酸盐，简称乙基-CDI。

　　该液常用于多肽类激素的固定，对酶等蛋白质固定效果良好，对细胞内抗原定位，超微结构保存好，是一种培养细胞电镜免疫细胞化学研究的良好固定剂。

　　（3）Zenker’s 液（重铬酸钾2.5g,氯化汞5g,硫酸钠1g,蒸馏水100ml,混合溶解后，临用时加水醋酸5ml）。

　　该固定液对免疫球蛋白染色最佳，固定时间约2-4h，染色前必须脱汞色素。

　　3．丙酮及醇类固定剂　　系最初免疫细胞化学染色的固定剂，其作用是沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强，保存抗原的免疫活性较好。但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，解决的办法是和其它试剂混合使用，如加冰醋酸、乙醚、氯仿、甲醛等。

　　（1）Clarke氏改良剂（100%酒精95ml，冰醋酸5ml），用于冰冻切片的后固定。

　　（2）乙醚（或氯仿）与乙醇等量混合液。

　　Danos（1976）等认为其组织穿透性极强，即使涂片上富于过多的粘液，固定效果仍然良好，是理想的细胞固定液。

　　（3）AAF液：95%-100%酒精85ml，冰醋酸5ml，浓甲醛10ml。

　　（4）Carnoy氏液：100%酒精60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml，混合后4。C保存备用。

　　（5）Methacarn氏液：甲醇60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml，混合后4。C保存备用。

　　以上两种固定液适宜某些抗原，癌基因蛋白产物检测的 固定，P53抗癌基因蛋白产物，PC-NA等抗原的保存。

　　丙酮的组织穿透性和脱水性更强，常用于冰冻切片及细胞涂片的后固定，保存抗原性较好，平时4。C低温保存备用，临用时，只需将涂片或冰冻切片插入冷丙酮内5-10min，取出后自然干燥，贮存于低温冰箱备用。

　　以上介绍了免疫组织化学中常用的固定液，用于免疫组化的固定剂种类很多（见附录），不同的抗原和标本需经过反复试验，选用最佳固定液。不少学者认为，迄今尚无一种标准固定液可以用于各种不同的抗原固定。而且同一固定液固定的组织，免疫组化染色标记结果可截然不同，致使人们无所适从。

选择最佳固定液标准是：

①最好地保持细胞和组织的形态结构。

②最大限度地保存抗原的免疫活性。一些含重金属的固定液在免疫组化技术中是禁用的。

实际经验告诉我们，中性缓冲福尔马林（或多聚甲醛）是适应性较广泛的固定液，但固定时间不宜过长。必要时，可作多种固定液对比，从而选出理想的标准固定液。

固定组织时应注意：

①应力求保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理。

②组织块不易过大过厚，必须小于2cm×1.5cm×0.3cm，尤其是组织块厚度必须控制在0.3cm以内。

③固定液必须有足够的量，在体积上一般大于组织20倍以上，否则组织中心固定不良影响效果。

④组织固定后应充分水洗，去除固定液造成的人为假象。

注：PBS:PBS缓冲液配制：NaCl 16g,　　 Na2HPO4(12H2O)　5.65g,KCl　0.4g 　,
KH2PO4　0.4g加双蒸水至1000ml pH7.0。