TRAP法端粒酶活性检测实验操作方法及疑难解答

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Kim应当不会预测到，他在1994年发明的TRAP会那么受欢迎，被一代又一代的研究者奉为端粒酶活性检测首选方法。不过，TRAP法虽然灵敏度高，却同样存在瑕疵。下面为大家介绍的是根据TRAP法适当改良的研究专用试剂盒具体情况和使用方法以及常见问题 解答。

本品与通常的端粒酶 活性测定法相比较，具有以下特征：

·内标与端粒酶提取液在同一管里进行PCR 扩增，提高了检测的准确性。

·提供了阳性对照，可以更加准确地判定阳性实验结果。

·优化了引物设计 ，使PCR 效果进一步提高。

使用须知

本试剂盒为研究用试剂，不能将其作为诊断或临床检测试剂使用。

背景知识

端粒酶 是合成染色体末端的端粒的酶。端粒(telomere)是真核细胞染色体的天然末端，由上千个6 碱基重复序列(TTAGGG)组成，是细胞必需的遗传组分，它的作用是维持端粒有足够的长度，保证基因信息在复制过程中的准确性，以防止染色体末端遗传信息的丢失。

在正常情况下，每个细胞分裂周期都会使端粒变的越来越短，当端粒短到一定程度时就会发出信号，细胞停止分裂。

端粒酶由RNA 和蛋白质亚基组成，是基本的核蛋白逆转录酶，在细胞染色体复制过程中，能够以自身RNA 为模板，在染色体3’末端合成重复序列，维持端粒的长度。端粒酶在正常体细胞中的活性被抑制，但是大量的资料表明在一些恶性肿瘤中的表达高达85%。

由于端粒酶特异地表达于各种肿瘤细胞，并且是大多数肿瘤细胞持续分裂所必需的。因此，端粒酶活性是诊断多数恶性肿瘤、判断愈后的良好指标。

基本原理

利用端粒酶在体外可以以其自身RNA 的模板区为模板，在适宜的寡核苷酸链的末端添加6 个碱基的重复序列的特性，采用PCR 方法扩增此重复序列，并进而用聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶电泳显示6 个碱基差异的梯带。

1994 年Kim 建立的TRAP 法，其主要原理如下：首先合成一个18nt 的TS 做上游引物，端粒酶结合TS 末端的GTT 并合成AGGGTTAG，然后每经过一次转位合成一个ggttag 的6 碱基重复序列，端粒酶灭活后，加入CX 做下游引物，经过多次变性-退火-延伸，扩增端粒酶延伸产物。

我公司提供的PCR端粒酶活性检测试剂盒基于同样的的原理，利用银染技术检测端粒酶的活性。阳性结果在凝胶电泳上显示相隔6bp 的梯状条带，条带的多、寡、深或浅表示端粒酶活性的大小。

TRAP-银染法保留了传统TRAP 法灵敏度高、特异性强等优点，避免了同位素的放射污染。同时，还增设了内标准物，提供阳性对照品，优化了引物设计，使PCR效果进一步提高，使之能够高灵敏的检测到细胞和组织提取物中端粒酶的活性。

TRAP-银染法端粒酶活性检测试剂实验方法

试剂盒组份

组分 50 次实验量

Wash buffer 11ml

Lysis buffer 2.2ml

10×PCR buffer 140μl

dNTPs 165μl

Primer1 165μl

Primer2 28μl

Primer3 110μl

Taq -DNA Polymerase 17μl

ddH2O 750μl

阳性对照模板 55μl

内标准模板 55μl

操作步骤

1、端粒酶的提取

⑴ 手术后取下的活组织，立即保存在液氮之中。

⑵ 40～100mg 冷冻(-70%℃)组织用无菌眼科手术剪尽量剪碎，研磨器研磨，加入40 ul Lysis buffer(使用前每ml Lysis buffer 加入2μlβ-巯基乙醇);或1～2×106 沉淀细胞直接加入40μl 预冷的Lysis buffer，悬浮细胞，涡旋振荡10s, 置冰浴中30min，每间隔数分钟涡旋振荡一次，共5-6 次。

备注：为了获取比较理想的端粒酶提取液，建议在一些干硬组织中适当加入Washbuffer。

⑶ 4℃离心(13000rpm,20min)。

⑷ 移取上清，分装3-4 管，每管约20μl。其中一份样品用于蛋白质浓度定量，其余迅速冷冻，-70℃保存。

2、 PCR 扩增(1×25ul)

Ⅰ液(μl) Ⅱ液(μl)

ddH2O 7.5 5.5

10×buffer 0.5 2

dNTPs 0.5 2.5

Primer1 0.5 2.5

Primer 2 0 0.5

Taq-DNA polymerase 0 0.3

内标准模板 1 1

Primer 3 2 2

3、 PCR 扩增：

⑴ 每管加入Ⅰ液9μl 及端粒酶提取液1μl，混匀，30℃反应30min。

⑵ 上述各管93℃加热1min 灭活。

⑶ 向上述各管中加入预热至93℃的Ⅱ液各13ul，混匀，进行第一步扩增。扩增

条件如下：

第一步：

步骤 时间 温度

预变性 3m 93℃

变性 35s 93℃

退火 35s 42℃

延伸 90s 72℃

循环数 5

延伸 60s 72℃

⑷ 在第一步扩增最后一个循环的延伸一步的最后几秒，暂停仪器运行，快速向各管中加入primer3 2ul 和内标准模板1ul。继续运行仪器，进行第二步扩增。扩增条件如下：

第二步(连接第一步)：

步骤 时间 温度

预变性 60s 93℃

变性 40s 93℃

退火 40s 60℃

延伸 50s 72℃

循环数 36

延伸 8m 72℃

4、 10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(所有溶液，用户自备)

⑴ 制备10%非变性聚丙烯酰胺凝胶(20ml)。

ddH2O 11.19 ml

36%Acr-1%Bis 5.46 ml

5%TEMED 0.4 ml

10×电泳缓冲液 2 ml

1.25% APS 1 ml

⑵ 取10ul PCR 产物与2ul 上样缓冲液混合后加样，用0.5×电泳缓冲液作为电极缓冲液，180V 电泳2h。

⑶ 小心剥离凝胶，并置于50%甲醇、10%醋酸中，固定过夜。

备注：① 10×电泳缓冲液：15g Tris 、14g 硼酸和1.17g EDTA (不带2Na) ，用ddH2O 定容至200ml。

② 10×上样缓冲液：0.01%溴酚兰、40%甘油、62.5mM Tris-HCl(pH 6.7)

5、银染(所有溶液，用户自备)

⑴ 将凝胶置于10%醋酸固定30min 后用蒸馏水漂洗3 次，每次5min;

⑵ 将凝胶置于0.2g/L 硫代硫酸钠浸泡1min, 然后用蒸馏水漂洗3 次，每次30s;

⑶ 将凝胶置于硝酸银染液中浸泡30min, 然后用蒸馏水漂洗30s;

⑷ 将凝胶置于显影液中显色10min 左右直到全部条带显色清晰为止;

⑸ 将凝胶置于5%醋酸中浸泡终止反应。

⑹ 选择适当时机照相。

备注：

① 硝酸银染液：0.2g AgON3、25ul 37%甲醛，定容至100ml。

② 显色液：3g Na2CO3、25ul 37%甲醛、0.4mg 硫代硫酸钠，定容至100ml。

6、使用凝胶分析软件进行结果分析

实验方法的说明

1 端粒酶的提取： 端粒酶本身有RNA 和酶功能基团，极其容易被降解、失活。因此，应该按提取细胞总RNA 的要求，尽量在低温条件下，快速操作。简化不必要的反复洗涤程序，

提高提取液的蛋白质浓度。小量分装，尽量避免反复冻融。

2 反应前，测定每个样品的蛋白质浓度，并稀释至同一浓度，以保证端粒酶样品加入量基本一致。

3 为了让实验更具有客观性，实验时，请务必设定阳性对照和阴性对照，本试剂盒提供阳性对照的模板，并提供阴性对照的实验方法。

阳性对照的实验方法：另设一阳性对照管，以阳性对照模板代替端粒酶提取液加入即可。

阴性对照的实验方法：可以把Ⅰ液Ⅱ液混合，每管24ul 混合液，再加入端粒酶提取液，混匀后直接在90℃加热10min 灭活，不经过PCR 扩增，直接电泳，以排除样品中存在的蛋白质对核酸银染的干扰。

4 关于内标准模板的使用 为了便于进行各样品间端粒酶活性的比较，我们提供了内标准物。该内标准物可以作为模板，用于检测端粒酶活性的同一对引物进行扩增。内标准模板扩增片段长度为：50bp。该内标准物的使用有两种方法：

第一种方法：将内标准物以一定量加入到端粒酶样品之中，用同一对引物在同一扩增管内进行竞争性扩增。然后通过比较电泳图谱中内标准物和端粒酶扩增带的相对强度，即可达到相对定量的目的。

考虑到实验方法的灵敏度，并避免PCR 扩增时的平台效应，只有当端粒酶的模板(与其活性相对应)和内标的模板比例相接近时，方能得到较理想的分析效果。

基于不同来源样品的端粒酶的活性不同，需要将高浓度的模板进行一系列的稀释，比如依次稀释为100、1000、10000、100000、1000000 等倍数，分别取1ul 与等体积的端粒酶样品混合后作为模板，进行扩增。

选择一个内标准物和端粒酶均能明显扩增的稀释度用于今后的实验。此种方法从理论上讲更严谨，考虑到了模板的长度，扩增效果和端粒酶活性的关系，但是需要客户自己摸索最佳条件。

第二种方法：是将我们提供的高浓度内标准物，在进行电泳时加入。这样也能够实现半定量分析，而且方法简单可行。

常见问题

1. 细胞提取物中没有足够的端粒酶：在冰浴条件下制备细胞和组织提取物，尽量缩短制备时间，适当用较高浓度的端粒酶样品，减少不必要的操作。

2. 端粒酶的反应时间不够：保证反应时间不少于20min。

3. 所有样品和阴性对照都成阳性：PCR 残余污染。PCR 反应的每一组分勿重复使用保证使用洁净的PCR 管和PCR 试管架

4. 同一种组织会有不同的端粒酶的表达活性：动物本身就有种内差，每个个体的端粒酶的表达活性情况也会不一样。 同一个体的不同组织(如睾丸/骨髓)端粒酶的表达也不一定相同。同一个体的同一组织的不同部位端粒酶的表达情况也不一定相同。

5. 肿瘤组织中没有出现预期的端粒酶条带：肿瘤组织中端粒酶的表达达85%，也有部分肿瘤组织中没有端粒酶的表达，所以极少数肿瘤组织中有可能没有出现端粒酶的条带。

6. 阳性对照中看不到梯度：因反复冻融会导致阳性对照中的端粒酶失活，所以应注意低温操作。

7. 阴性对照里有梯度条带出现：PCR 产物、buffer A 及反应试剂等交叉污染，请将PCR 扩增产物提取区域和反应试剂配制区域分开。另外请经常使用手套。电泳上样时的交叉污染，每次上样时更换枪头。

8. 由于热处理、RNase 处理不充分而引起梯度条带消失：将要使用的枪头用DEPC 水浸泡至少24 小时，再进行高压灭菌，烤干;提取样品所用的玻璃制品、陶瓷品及手术器械等经烤箱170℃烘烤5 个小时。

9. 端粒酶活性不高：改善端粒酶反应条件，适当增加端粒酶反应时间，适当增加PCR 循环数(但要避免达到平台效应，使非特异性扩增大量出现)，避免buffer A 的恶化，尽量减少端粒酶样品反复冻融。实验操作的指导原则是快速，低温。

质量检测报告

产品名称：TRAP-银染法端粒酶活性检测试剂盒(TRAP-Silver Staining Telomerase DetectionKit)

HL-60 细胞在37℃，5%CO2 培养箱培养，并利用本试剂盒进行检测，经电泳检测PCR产物，呈现阳性梯带，视为合格。

端粒酶的提取应按总RNA 的要求操作，尽量在低温条件下，快速操作。端粒酶的反应时间应不少于二十分钟，为避免PCR残余污染，应保证实验中用到的试剂及仪器、管子洗涤干净，而且上样时注意更换枪头。