TRAP检测法检测端粒酶活性

TRAP 检测法检测端粒酶活性的基本原理是通过具有活性的端粒酶催化，将端粒重复序列（GGTTAG）加到一个寡核苷酸底物 TS 的 3＇末端，然后通过 PCR 扩增 30～33 个循环，通过在反应中的 TS 引物上引入放射性同位素 y-32P-ATP 标记，对 PCR 产物采用聚丙烯酰胺电泳检测，最后采用放射性自显影检测并分析扩增结果。

另外也可以不对引物进行放射性同位素标记，而是采用非放射性的 SYBRGreen 染料对 PCR 产物进行染色鉴定，分析并量化出端粒酶的活性。

器材：

① 组织研磨器

② 紫外分光光度仪

③ PCR 仪

④ 垂直电泳槽

⑤ 紫外凝胶成像系统

⑥ 待测细胞或组织样品细胞。

试剂：

① 聚丙烯酰胺凝胶试剂

② Taq DNA 聚合酶;

③ dNTP Mix。

④ SYBR Green 染料

⑤ TRAP 检测法引物（包括 TS引物，RP引物，K1引物，TSK1引物）;

⑥ 1x CHAPS 缓冲液（10 mmol/L Tris-HCI，pH7.5，1 mmol/L MgCl_2，1 mmol/L EGTA，0.1 mmol/L 苯甲脒，5 mmol/L β-巯基乙醇，0.5％ CHAPS，10％ 丙三醇）

⑦ 10x TRAP 反应缓冲液（200 mmol/L Tris-HCI（pH8.3），15 mmol/L MgCl₂，630 mmol/L KCI，0.5% Tween-20，10 mmol/L EGTA）

TRAP 检测法检测端粒酶活性的基本过程可分为如下几步：

B TRAP 反应设置，在每个反应中加入模板 2 μl，10x TRAP 反应缓冲液 5 μl，50x dNTP Mix 1 μl，TS引物 1 μl，TRAP 检测法引物（含 RP引物，K1引物，TSK1引物）1 μl，Taq DNA 聚合酶（5 U/μl）0.4 μl，ddH₂O 39.6 μl。

C PCR 扩增，PCR 反应条件为：30 ℃ 孵育 30 min，然后进行两步 30 个循环，包括 94 ℃ 变性 30 s，59 ℃ 退火／延伸混合 30 s。反应实际是一个共同缓冲液，双酶系统的反应，在第一个酶系统的反应中，端粒酶将一定数量的端粒重复序列（GGTTAG）转到了寡核苷酸底物 TS 的 3＇末端，而在第二个酶系统的反应中，TS 和 RP引物则可以扩增出一个以 6 碱基递增的产物梯度，如从 50 个核酸开始的：50，56，62，68•••••片段。

D 反应产物电泳及显色反应，将 PCR 反应产物上样到 10％ 聚丙烯酰胺凝胶中，1x TBE 缓冲液电泳，1:10000 SYBR Green 对凝胶进行染色 15 min 后拍摄照片。

1 1x CHAPS 缓冲液裂解细胞应在冰上进行，组织样品比较难于裂解，可能需要用到电动匀浆器，注意应在冰上研磨，避免温度过高，离心应采用冷冻离心机以防止端粒酶遇热降解。