细胞悬浮系的建立与种细胞筛选

1. 细胞悬浮系的建立

1.1 实验材料

胡萝卜上胚轴经黑暗培养形成的愈伤组织（可与体细胞胚诱导实验同时培养）。

1. 2 培养基

MS无机盐附加：烟酸0.05mg/L、VB6和VB1各0.01mg/L、甘氨酸3mg/L、肌醇100mg/L、激动素0.2mg/L、2,4-D 0.1mg/L、蔗糖20g/L，pH5.8。

1.3 实验操作

a. 按照培养基配方配制液体培养基，分装于200ml三角瓶中，每瓶30-50ml培养基，灭菌待用；

b. 在净化工作台上，将复合要求的松散愈伤组织用细胞铲接种于含有培养基地三角瓶中。接种量大约为培养基体积的十分之一；

c. 接种后的三角瓶置于摇床上，在转速100rpm，25℃下光照培养；

d. 每隔4周将悬浮培养物继代1次，方法是把5ml培养物转移到50ml新鲜培养基中（1:10），如果有大的细胞块，则在继代时先用一细胞筛过滤除去过大的细胞块，在进行接种。

2. 种细胞的筛选

种细胞的筛选是为细胞次生产物生产提供高产细胞系的中间环节，为了获得高效一致的细胞产量和产物产量，根据不同的植物和产物类型，有不同的筛选方法。其基本操作是单细胞平板培养。

a. 将细胞悬浮系在上述培养基和培养条件下，每隔7天继代一次，每次按细胞悬液与新鲜培养基1:5的比例接种；

b. 将新鲜配制的 琼脂 培养基在未凝固前，与处于对数生长期的细胞悬浮液按4:1混合后，平铺在培养皿中，操作时特别注意温度不能过高，以免给细胞造成伤害。如果悬浮系中的有过大的细胞团，需过滤除去大的细胞团。

c. 在细胞分裂形成可见的小愈伤组织时，将单个细胞的愈伤组织分别接种在平板培养基上单独培养，由每个细胞形成的愈伤组织即为一个细胞系（clone）。